斜紋夜蛾誘導(dǎo)大豆抗蟲(chóng)防御反應(yīng)轉(zhuǎn)錄譜分析和分子功能研究.pdf

1、植物和昆蟲(chóng)在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，形成了復(fù)雜而精細(xì)的抗性反應(yīng)機(jī)制。大豆是一種具有3000年悠久栽培歷史的的重要糧食作物。由于大豆在糧食、油料、飼料、工業(yè)原料等多領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用，人類(lèi)對(duì)大豆的需求日益增加。然而蟲(chóng)害嚴(yán)重影響了大豆農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的品質(zhì)和產(chǎn)量。對(duì)大豆誘導(dǎo)抗蟲(chóng)防御反應(yīng)進(jìn)行相關(guān)研究對(duì)于提高植物自身抗蟲(chóng)性，減少化學(xué)殺蟲(chóng)劑的使用、保護(hù)環(huán)境等具有重要意義。
　　本研究選取了相對(duì)抗蟲(chóng)和感蟲(chóng)的萬(wàn)縣白冬豆和南農(nóng)99-10兩個(gè)大豆品種，經(jīng)過(guò)斜紋夜

2、蛾誘導(dǎo)處理48 h之后考察抗感品種在誘導(dǎo)處理后的6個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)所產(chǎn)生的誘導(dǎo)抗性水平變化。結(jié)果表明抗感品種達(dá)到最高誘導(dǎo)抗蟲(chóng)水平的時(shí)間點(diǎn)分別在蟲(chóng)誘導(dǎo)之后5天和蟲(chóng)誘導(dǎo)之后1天。為了進(jìn)一步理解大豆不同品種誘導(dǎo)抗性的分子機(jī)理并鑒定出參與大豆誘導(dǎo)抗蟲(chóng)防御反應(yīng)的防御基因，本研究利用基因芯片結(jié)合RNA-Seq測(cè)序技術(shù)對(duì)蟲(chóng)誘導(dǎo)處理后的大豆抗感品種在誘導(dǎo)抗性最高時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄譜分析。芯片檢測(cè)結(jié)果鑒定到抗性品種中的827個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，感性品種中249個(gè)基

3、因上調(diào)表達(dá)，100個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。共80個(gè)基因在抗感品種中表達(dá)調(diào)控重疊，其中73個(gè)基因方向一致，另有7個(gè)基因在抗性品種中上調(diào)，在感性品種中下調(diào)。對(duì)芯片結(jié)果中的差異基因分別進(jìn)行功能分析結(jié)果表明共表達(dá)差異基因列中主要是防御脅迫相關(guān)的基因，比例為19％;只在大豆抗蟲(chóng)品種中上調(diào)表達(dá)的基因列中轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)基因比例最多達(dá)到14％;只在感性品種上調(diào)的差異基因列中也是防御脅迫相關(guān)的基因最多，比例為12％;另外在感性品種中下調(diào)的基因中參與初生代謝反應(yīng)的基

4、因最多，比例為13％。另一方面，RNA-Seq數(shù)據(jù)分析共檢測(cè)到了781個(gè)基因在抗性品種中上調(diào)表達(dá)，231個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。感性品種中檢測(cè)到874個(gè)上調(diào)表達(dá)，以及706個(gè)下調(diào)表達(dá)。其中132個(gè)基因在抗感品種中都上調(diào)表達(dá)，32個(gè)基因共下調(diào)表達(dá)，以及15個(gè)基因在抗感品種中相反方向的表達(dá)。與芯片結(jié)果相比，RNA-Seq鑒定到了更多的差異基因。RNA-Seq的結(jié)果中抗感品種鑒定的上調(diào)基因數(shù)目相差不大，與芯片結(jié)果一致的是，RNA-Seq的感性品種結(jié)果

5、中鑒定到更多的下調(diào)基因。對(duì)RNA-Seq五列差異基因功能分析結(jié)果表明，芯片中比較顯著的幾個(gè)功能分類(lèi)在RNA-Seq功能分類(lèi)結(jié)果中也都很顯著。
　　對(duì)兩組轉(zhuǎn)錄譜數(shù)據(jù)的比較分析生成了一致檢測(cè)到的抗感共表達(dá)差異基因列表，以及抗感品種特異表達(dá)差異基因的列表。熒光定量PCR對(duì)這些基因列表中21個(gè)感興趣的基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果表明有些基因的表達(dá)倍數(shù)在不同方法之間會(huì)有一些差別，但是表達(dá)的方向在三種方法的結(jié)果中基本一致。除此之外，對(duì)六個(gè)抗蟲(chóng)防御相關(guān)的基

6、因展開(kāi)的時(shí)空表達(dá)分析結(jié)果表明蟲(chóng)誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)基因在局部被咬葉片和完整葉片中的表達(dá)會(huì)有差異并且具有一定的時(shí)間規(guī)律。局部反應(yīng)的最高峰時(shí)間一般都比較靠前，而大部分基因的系統(tǒng)表達(dá)水平最高峰時(shí)間則比較滯后，并且與之前誘導(dǎo)抗蟲(chóng)動(dòng)態(tài)分析結(jié)果中的誘導(dǎo)抗蟲(chóng)水平變化時(shí)間點(diǎn)較為一致。
　　對(duì)候選基因中編碼一種酸性磷酸酶的大豆?fàn)I養(yǎng)儲(chǔ)藏蛋白(VSPβ)基因和編碼大豆抗毒素合成途徑中的異黃酮還原酶(N∶IFR)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因煙草功能分析結(jié)果表明，在活體植

7、株強(qiáng)迫飼喂實(shí)驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)Gm VSP和GmN∶IFR的轉(zhuǎn)基因煙草葉片損失明顯較少，對(duì)應(yīng)斜紋夜蛾的相對(duì)生長(zhǎng)率顯著下降。在斜紋夜蛾自由取食實(shí)驗(yàn)中，GmVSPβ轉(zhuǎn)基因煙草株系葉片的損失明顯少于野生型煙草葉片的損失，與轉(zhuǎn)基因煙草相比，斜紋夜蛾更喜歡取食野生型煙草葉片。此外，轉(zhuǎn)基因煙草植株中與與抗蟲(chóng)相關(guān)的茉莉酸合成途徑的脂氧合酶(LOX)和丙二烯氧化物合酶(AOS)基因以及參與尼古丁合成途徑的腐胺—N—甲基轉(zhuǎn)移酶(PMT)基因和類(lèi)異黃酮還原酶基因

8、A622表達(dá)量都發(fā)生了相應(yīng)變化。其中LOX3，AOS，PMT三個(gè)基因在Gm VSP和GmN∶IFR轉(zhuǎn)基因煙草株系中的表達(dá)量都有所提高，而A622基因的表達(dá)水平只在GmVSPβ轉(zhuǎn)基因煙草株系中提高，在GmN∶IFR轉(zhuǎn)基因煙草株系中的表達(dá)量與對(duì)照相比反而下降。
　　為了探索前期在轉(zhuǎn)錄譜結(jié)果中鑒定到的一系列轉(zhuǎn)錄因子在植物防御網(wǎng)絡(luò)中的作用以及與Gm VSPa、Gm VSP和GmN∶IFR防御相關(guān)基因啟動(dòng)子的互作反應(yīng)。本研究利用PCR擴(kuò)增技

9、術(shù)成功獲得了GmVSPa、Gm VSP和GmN∶IFR基因?qū)?yīng)的上游啟動(dòng)子序列和包括MYBs，WRKYs，NACs，bZIP，DREB在內(nèi)的12個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的編碼序列。利用PLACE和PlantCARE啟動(dòng)子順式作用元件分析數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)三個(gè)基因啟動(dòng)子進(jìn)行的預(yù)測(cè)分析及功能分類(lèi)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)防御脅迫相關(guān)順式作用元件。其中，GmVSPβ和GmN∶IFR啟動(dòng)子中預(yù)測(cè)到的防御脅迫相關(guān)順式作用元件遠(yuǎn)多于GmVSPa啟動(dòng)子中預(yù)測(cè)到的防御脅迫相關(guān)順式作用元

10、件。瞬時(shí)表達(dá)活性分析結(jié)果表明不同轉(zhuǎn)錄因子對(duì)GmVSPa、GmVSPβ和GmN∶IFR基因啟動(dòng)子活性的調(diào)控能力不同，GmbZIP110和GmWRKY39顯著促進(jìn)了GmVSPa啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)活性的提高;多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子主要包括GmbZIP110和GmWRKY39顯著促進(jìn)了GmVSPβ啟動(dòng)子表達(dá)活性提高;GmMYB75，Gm WRKY39和GmWRKY20顯著促進(jìn)了GmN∶IFR啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)活性提高。這部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果鑒定到的個(gè)別具有關(guān)