斜紋夜蛾誘導(dǎo)大豆抗蟲防御反應(yīng)轉(zhuǎn)錄譜分析和分子功能研究.pdf

1、植物和昆蟲在長期的進化過程中，形成了復(fù)雜而精細的抗性反應(yīng)機制。大豆是一種具有3000年悠久栽培歷史的的重要糧食作物。由于大豆在糧食、油料、飼料、工業(yè)原料等多領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用，人類對大豆的需求日益增加。然而蟲害嚴(yán)重影響了大豆農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的品質(zhì)和產(chǎn)量。對大豆誘導(dǎo)抗蟲防御反應(yīng)進行相關(guān)研究對于提高植物自身抗蟲性，減少化學(xué)殺蟲劑的使用、保護環(huán)境等具有重要意義。
　　本研究選取了相對抗蟲和感蟲的萬縣白冬豆和南農(nóng)99-10兩個大豆品種，經(jīng)過斜紋夜

2、蛾誘導(dǎo)處理48 h之后考察抗感品種在誘導(dǎo)處理后的6個不同時間點所產(chǎn)生的誘導(dǎo)抗性水平變化。結(jié)果表明抗感品種達到最高誘導(dǎo)抗蟲水平的時間點分別在蟲誘導(dǎo)之后5天和蟲誘導(dǎo)之后1天。為了進一步理解大豆不同品種誘導(dǎo)抗性的分子機理并鑒定出參與大豆誘導(dǎo)抗蟲防御反應(yīng)的防御基因，本研究利用基因芯片結(jié)合RNA-Seq測序技術(shù)對蟲誘導(dǎo)處理后的大豆抗感品種在誘導(dǎo)抗性最高時間點進行了轉(zhuǎn)錄譜分析。芯片檢測結(jié)果鑒定到抗性品種中的827個基因上調(diào)表達，感性品種中249個基

3、因上調(diào)表達，100個基因下調(diào)表達。共80個基因在抗感品種中表達調(diào)控重疊，其中73個基因方向一致，另有7個基因在抗性品種中上調(diào)，在感性品種中下調(diào)。對芯片結(jié)果中的差異基因分別進行功能分析結(jié)果表明共表達差異基因列中主要是防御脅迫相關(guān)的基因，比例為19％;只在大豆抗蟲品種中上調(diào)表達的基因列中轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)基因比例最多達到14％;只在感性品種上調(diào)的差異基因列中也是防御脅迫相關(guān)的基因最多，比例為12％;另外在感性品種中下調(diào)的基因中參與初生代謝反應(yīng)的基

4、因最多，比例為13％。另一方面，RNA-Seq數(shù)據(jù)分析共檢測到了781個基因在抗性品種中上調(diào)表達，231個基因下調(diào)表達。感性品種中檢測到874個上調(diào)表達，以及706個下調(diào)表達。其中132個基因在抗感品種中都上調(diào)表達，32個基因共下調(diào)表達，以及15個基因在抗感品種中相反方向的表達。與芯片結(jié)果相比，RNA-Seq鑒定到了更多的差異基因。RNA-Seq的結(jié)果中抗感品種鑒定的上調(diào)基因數(shù)目相差不大，與芯片結(jié)果一致的是，RNA-Seq的感性品種結(jié)果

5、中鑒定到更多的下調(diào)基因。對RNA-Seq五列差異基因功能分析結(jié)果表明，芯片中比較顯著的幾個功能分類在RNA-Seq功能分類結(jié)果中也都很顯著。
　　對兩組轉(zhuǎn)錄譜數(shù)據(jù)的比較分析生成了一致檢測到的抗感共表達差異基因列表，以及抗感品種特異表達差異基因的列表。熒光定量PCR對這些基因列表中21個感興趣的基因表達檢測結(jié)果表明有些基因的表達倍數(shù)在不同方法之間會有一些差別，但是表達的方向在三種方法的結(jié)果中基本一致。除此之外，對六個抗蟲防御相關(guān)的基

6、因展開的時空表達分析結(jié)果表明蟲誘導(dǎo)后不同時間點內(nèi)基因在局部被咬葉片和完整葉片中的表達會有差異并且具有一定的時間規(guī)律。局部反應(yīng)的最高峰時間一般都比較靠前，而大部分基因的系統(tǒng)表達水平最高峰時間則比較滯后，并且與之前誘導(dǎo)抗蟲動態(tài)分析結(jié)果中的誘導(dǎo)抗蟲水平變化時間點較為一致。
　　對候選基因中編碼一種酸性磷酸酶的大豆?fàn)I養(yǎng)儲藏蛋白(VSPβ)基因和編碼大豆抗毒素合成途徑中的異黃酮還原酶(N∶IFR)基因進行轉(zhuǎn)基因煙草功能分析結(jié)果表明，在活體植

7、株強迫飼喂實驗中，過表達Gm VSP和GmN∶IFR的轉(zhuǎn)基因煙草葉片損失明顯較少，對應(yīng)斜紋夜蛾的相對生長率顯著下降。在斜紋夜蛾自由取食實驗中，GmVSPβ轉(zhuǎn)基因煙草株系葉片的損失明顯少于野生型煙草葉片的損失，與轉(zhuǎn)基因煙草相比，斜紋夜蛾更喜歡取食野生型煙草葉片。此外，轉(zhuǎn)基因煙草植株中與與抗蟲相關(guān)的茉莉酸合成途徑的脂氧合酶(LOX)和丙二烯氧化物合酶(AOS)基因以及參與尼古丁合成途徑的腐胺—N—甲基轉(zhuǎn)移酶(PMT)基因和類異黃酮還原酶基因

8、A622表達量都發(fā)生了相應(yīng)變化。其中LOX3，AOS，PMT三個基因在Gm VSP和GmN∶IFR轉(zhuǎn)基因煙草株系中的表達量都有所提高，而A622基因的表達水平只在GmVSPβ轉(zhuǎn)基因煙草株系中提高，在GmN∶IFR轉(zhuǎn)基因煙草株系中的表達量與對照相比反而下降。
　　為了探索前期在轉(zhuǎn)錄譜結(jié)果中鑒定到的一系列轉(zhuǎn)錄因子在植物防御網(wǎng)絡(luò)中的作用以及與Gm VSPa、Gm VSP和GmN∶IFR防御相關(guān)基因啟動子的互作反應(yīng)。本研究利用PCR擴增技

9、術(shù)成功獲得了GmVSPa、Gm VSP和GmN∶IFR基因?qū)?yīng)的上游啟動子序列和包括MYBs，WRKYs，NACs，bZIP，DREB在內(nèi)的12個轉(zhuǎn)錄因子的編碼序列。利用PLACE和PlantCARE啟動子順式作用元件分析數(shù)據(jù)庫對三個基因啟動子進行的預(yù)測分析及功能分類結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了多個防御脅迫相關(guān)順式作用元件。其中，GmVSPβ和GmN∶IFR啟動子中預(yù)測到的防御脅迫相關(guān)順式作用元件遠多于GmVSPa啟動子中預(yù)測到的防御脅迫相關(guān)順式作用元

10、件。瞬時表達活性分析結(jié)果表明不同轉(zhuǎn)錄因子對GmVSPa、GmVSPβ和GmN∶IFR基因啟動子活性的調(diào)控能力不同，GmbZIP110和GmWRKY39顯著促進了GmVSPa啟動子驅(qū)動報告基因的表達活性的提高;多個轉(zhuǎn)錄因子主要包括GmbZIP110和GmWRKY39顯著促進了GmVSPβ啟動子表達活性提高;GmMYB75，Gm WRKY39和GmWRKY20顯著促進了GmN∶IFR啟動子驅(qū)動表達活性提高。這部分的實驗結(jié)果鑒定到的個別具有關(guān)