西瓜果實(shí)類胡蘿卜素代謝相關(guān)基因的克隆、表達(dá)與遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、類胡蘿卜素為以多個(gè)共軛的碳碳雙鍵為生色系骨架的脂肪族或脂環(huán)族類型化合物，是由植物和微生物合成的一大類色素，因具有多種醫(yī)學(xué)生物學(xué)功能而廣受關(guān)注。西瓜（Citrullus lanatus）屬于大眾化水果之一，瓜瓤所具有的紅、粉紅、黃、白等瓤色是由類胡蘿卜素組成與含量的差異所致的，研究西瓜類胡蘿卜素生物合成積累代謝，并進(jìn)行遺傳操作，探討其抗腫瘤作用，可為西瓜類胡蘿卜素的開發(fā)利用，進(jìn)行西瓜營養(yǎng)育種和種質(zhì)創(chuàng)新提供依據(jù)。
　　本課題從基因水平

2、上分析西瓜果實(shí)類胡蘿卜素合成代謝的調(diào)控機(jī)制，并建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的西瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系，試圖通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)西瓜果實(shí)類胡蘿卜素的成分進(jìn)行改良。此外，本課題還對(duì)番茄紅素和β-胡蘿卜素抗腫瘤作用的分子機(jī)制進(jìn)行研究。主要內(nèi)容如下：
　　利用 RT-PCR和 RACE技術(shù)從西瓜果實(shí)中分離獲得牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶基因GGPS和八氫番茄紅素合成酶基因PSY的cDNA全長序列，并通過生物信息學(xué)方法對(duì)其核酸及推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，（

3、1）西瓜GGPS基因cDNA序列全長1,445 bp（GenBank登錄號(hào)：KF914758），開放閱讀框?yàn)?,092 bp，編碼363個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量約39 kDa。西瓜GGPS氨基酸序列與同為葫蘆科的甜瓜和黃瓜GGPS的同源性高達(dá)96％和95%。預(yù)測(cè)GGPS蛋白N末端存在一段52位氨基酸組成的轉(zhuǎn)運(yùn)肽信號(hào)序列。（2）西瓜PSY基因 cDNA序列全長1,561 bp（GenBank登錄號(hào)：KC166870），開放閱讀框?yàn)?,26

4、6 bp，編碼421個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量約47.3 kDa。西瓜PSY氨基酸序列與同為葫蘆科的甜瓜和南瓜PSY的同源性分別高達(dá)95%和94%。預(yù)測(cè)PSY蛋白N末端存在一段43位氨基酸組成的轉(zhuǎn)運(yùn)肽信號(hào)序列，轉(zhuǎn)運(yùn)肽剪切后的PSY蛋白第209-231位氨基酸為一跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。
　　種植四種不同瓤色的西瓜：紅瓤“CN66”、粉瓤“CN62”、黃瓤“ZXG381”和白瓤“ZXG507”，采摘收集各發(fā)育和成熟時(shí)期（授粉后6天、12天、18

5、天、24天、30天、36天）的果實(shí)樣品，利用HPLC法檢測(cè)類胡蘿卜素的組成和含量，通過RT-qPCR技術(shù)分析類胡蘿卜素代謝相關(guān)酶基因（GGPS，PSY，PSY-A，PDS， ZDS，CRTISO，LCYB，CHYB，ZEP，NCED1，NCED2和 NCED3）的表達(dá)。結(jié)果顯示，紅瓤“CN66”和粉瓤“CN62”成熟果實(shí)中主要含番茄紅素，以及少量的八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、δ-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、葉黃素和紫黃質(zhì)。其中，番茄紅素在1

6、2 DAP時(shí)出現(xiàn)，在此后的發(fā)育時(shí)期，其含量逐漸增加并成為主要的類胡蘿卜素。在18-30 DAP期間，“CN66”中大多數(shù)類胡蘿卜素合成酶基因（包括GGPS）的表達(dá)量大幅增高，而代謝酶基因NCED1和NCED2的表達(dá)量較低，導(dǎo)致該時(shí)期類胡蘿卜素的大量積累；黃瓤“ZXG381”中主要含葉黃素和紫黃質(zhì)，并且在果實(shí)發(fā)育和成熟過程中，其二者含量分別與CHYB和ZEP基因的表達(dá)量呈正相關(guān)；在白瓤“ZXG507”果實(shí)發(fā)育過程中，始終只能檢測(cè)到痕量的葉

7、黃素和紫黃質(zhì)，主要?dú)w因于類胡蘿卜素合成酶基因（尤其GGPS）的表達(dá)量較低，而代謝酶基因NCED1則保持較高的表達(dá)量。該結(jié)果表明，類胡蘿卜素合成代謝相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，對(duì)不同瓤色西瓜果實(shí)中類胡蘿卜素的組成和含量具有十分重要的影響。
　　分別構(gòu)建由西瓜果實(shí)特異性AGPL1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)類胡蘿卜素合成相關(guān)酶基因（GGPS，PSY，LCYB）的植物表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中。建立西瓜品種“紅一號(hào)”的子葉體外再生體系和農(nóng)桿菌介導(dǎo)

8、的遺傳轉(zhuǎn)化體系，試圖將GGPS基因轉(zhuǎn)化西瓜。結(jié)果顯示，（1）以3 d齡的無菌苗子葉為外植體，接種至不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA1 mg/L+IAA0.2 mg/L中，獲得的誘導(dǎo)率最高；最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA0.1 mg/L+IBA0.2 mg/L。（2）不定芽誘導(dǎo)階段的卡那霉素篩選濃度為75 mg/L，生根階段的篩選濃度為40 mg/L。氨芐青霉素濃度為200 mg/L或頭孢霉素濃度為300 mg/L時(shí)，對(duì)外植體的生長無明

9、顯影響，可用于農(nóng)桿菌侵染后的脫菌和抑菌過程。外植體經(jīng)預(yù)培養(yǎng)2 d，用 OD600值0.5的農(nóng)桿菌EHA105（轉(zhuǎn)入植物表達(dá)載體pAGPL1-GGPS）菌液浸染10 min，再共培養(yǎng)3 d，有利于提高遺傳轉(zhuǎn)化的效率。經(jīng)PCR檢測(cè)，初步證實(shí)GGPS基因已經(jīng)導(dǎo)入西瓜植株，轉(zhuǎn)化頻率為1.33‰。
　　利用MTT法檢測(cè)番茄紅素和β-胡蘿卜素對(duì)人食管鱗癌細(xì)胞EC109增殖的影響，通過Western Blotting技術(shù)分析上述類胡蘿卜素對(duì)PP

10、AR?、p21WAF1/CIP1、Cyclin D1以及Cox-2蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，番茄紅素和β-胡蘿卜素（5-40μM）均能顯著抑制 EC109細(xì)胞增殖，其抑制程度與處理濃度和時(shí)間呈正相關(guān)，即呈劑量-時(shí)間依賴效應(yīng)；使用3μM GW9662（PPAR?特異性抑制劑）預(yù)處理，能夠部分減弱上述類胡蘿卜素對(duì)細(xì)胞的抑制作用；番茄紅素和β-胡蘿卜素（40μM）均能顯著促進(jìn)PPAR?和p21WAF1/CIP1表達(dá)，抑制Cyclin D1和C