類胡蘿卜素對成骨細胞代謝的調(diào)控研究.pdf

1、目的：
　　 骨折愈合及骨代謝消長是國際骨科學(xué)領(lǐng)域中最為關(guān)注的一大類健康問題。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，骨生長發(fā)育強勁衰弱與腎精盛衰關(guān)系密切。腎后天之精來源于脾精的滋養(yǎng)，故脾精不足，腎精虧虛，骨骼失養(yǎng)。而腎主骨生髓，髓生精血互化，血液運行濡養(yǎng)賴于腎精元氣的蒸騰氣化推動。若腎精不足，可致氣化失源，無力溫育激發(fā)推動臟氣，氣機升降出入失常，血失流暢，脈道澀滯乃至血瘀，反之血瘀有加重。腎虛，因此骨折愈合、骨的消長主要與腎虛、脾虛、血瘀有關(guān)，以補腎、健

2、脾、活血為原則；而活性氧與中醫(yī)證型關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，腎虛、脾虛、血瘀均與活性氧代謝有關(guān)，因此中藥干預(yù)骨折愈合、骨代謝疾?。ㄈ绻琴|(zhì)疏松癥、關(guān)節(jié)性疾病等）的作用機理可能與中藥某些具有較強清除活性氧功能的成分有關(guān)。
　　 類胡蘿卜素是一大類廣泛分布、具極強抗氧化功能的化合物，屬食藥兼顧類化合物，其對自由基（尤其是O2-、OH-、1O2）的淬滅能力遠遠強于維生素E。雖然類胡蘿卜素研究始于19世紀(jì)50年代，而在其與骨折愈合、骨代謝方面的研究

3、一直無人問津。上世紀(jì)90年代雖有關(guān)維生素A干預(yù)骨代謝的零星臨床報道，但直到2005年國際類胡蘿卜素科學(xué)年會上發(fā)表了一篇有關(guān)類胡蘿卜素與骨健康基礎(chǔ)研究報告后，世界機構(gòu)才開始關(guān)注這一領(lǐng)域中基礎(chǔ)性理論研究。就國內(nèi)此類研究而言，尤其是類胡蘿卜素中非維生素A源類化合物對骨折愈合、骨代謝調(diào)控的研究尚無報道。
　　 本課題研究目的通過從整體（D-半乳糖致衰老Wistar大鼠模型）-細胞（M3T3-E1成骨細胞模型）-分子（成骨細胞DNA）三個

4、水平層次、結(jié)合體內(nèi)（invivo）-體外（invitor）試驗研究不同分子結(jié)構(gòu)類胡蘿卜素（β，β-胡蘿卜素、蝦青素、番茄紅素、斑蝥黃質(zhì)、玉米黃素、葉黃素）順/反式異構(gòu)體對不同類型自由基（O2-、OH-、1O2）淬滅的效果，同時從基因、蛋白質(zhì)水平探索性研究了非維生素A源類胡蘿卜素（蝦青素、番茄紅素、斑蝥黃質(zhì)）對成骨細胞增殖與分化的調(diào)控機理，為進一步搞清此類化合物對骨代謝消長、骨折愈合干預(yù)作用可能的機理提供實驗依據(jù)，并為開發(fā)應(yīng)用防治此類骨病

5、的中藥復(fù)方開辟新的途徑。
　　 研究內(nèi)容與方法（1）制備、純化、鑒定6種不同類胡蘿卜素反式單體（2）體外誘導(dǎo)類胡蘿卜素反式單體異構(gòu)化為不同順式單體（3）不同類胡蘿卜素反式單體灌喂D-半乳糖致衰大鼠，對動物整體抗氧化能力；各臟器分布情況（含量、異構(gòu)體比例等）、抗氧化指標(biāo)；血清代謝動力學(xué)；骨代謝相關(guān)實驗指標(biāo)（股骨長度、重量、骨密度、骨鈣、骨磷、骨鎂、骨錳、羥脯氨酸含量、血鈣、血磷含量、ALP活性、骨的結(jié)構(gòu)力學(xué)和生物力學(xué)特點等）進行測

6、定（4）不同類胡蘿卜素反式單體處理H2O2損傷的M3T3-E1成骨細胞，對細胞存活率、SOD酶活性、ROS、LOP總量、DNA損傷以及細胞膜生物物理特性參數(shù)等進行測定（5）利用化學(xué)發(fā)光法、生物微弱發(fā)光法進行不同類胡蘿卜素順/反式單體體外淬滅不同自由基（O2-、OH-、1O2）效果的測定（6）不同非維生素A源類胡蘿卜素反式單體（蝦青素、斑蝥黃素、番茄紅素）處理M3T3-E1成骨細胞，對細胞增殖、分化、DNA含量、蛋白質(zhì)含量、ALP活性以及

7、關(guān)鍵代謝調(diào)控基因（ALP、CollagenI、RUNX2、TGFβ1、VEGF、BMP2、IGF-I、OPG、RANKL、RXR）進行測定結(jié)果（1）整體水平：將制備得到的β，β-胡蘿卜素、蝦青素、番茄紅素、斑蝥黃質(zhì)、玉米黃素、葉黃素反式單體分別灌喂D-半乳糖致衰老大鼠后，可以有效地降低血清TC、TG、LDL-c、TC/HDL-c、LDL-c/HDL-c及各臟器的MDA，升高血清、各臟器的SOD、GSH-Px酶活性，提高機體總抗氧化能力。

8、同時也可增加D-半乳糖致衰老大鼠的股骨長度、重量和骨密度，提高重要的骨礦物質(zhì)（鈣、磷、鎂、錳）、羥脯氨酸含量及其ALP活性，影響血鈣、磷的含量，改善骨的結(jié)構(gòu)力學(xué)和生物力學(xué)特點，減少衰老過程自由基對骨代謝的不良影響。
　　 （2）細胞水平：β，β-胡蘿卜素、蝦青素、番茄紅素、斑蝥黃質(zhì)、玉米黃素、葉黃素反式單體可有效地抑制H2O2對成骨細胞膜的損傷，降低細胞ROS、LPO含量，增加SOD酶活性，減少DNA損傷，提高細胞的存活率。實驗

9、發(fā)現(xiàn)，蝦青素、斑蝥黃質(zhì)和番茄紅素在基因表達水平上對成骨細胞ALP、CollagenI、RUNX2、TGFβ1、VEGF、BMP2、IGF-I、OPG、RANKL均有調(diào)控作用，在蛋白質(zhì)水平對ALP、OPG以及總蛋白含量積累也有上調(diào)影響，且與相應(yīng)的mRNA水平基本一致。
　　 此外，在調(diào)控RXR受體表達方面，3種類胡蘿卜素與維生素A存在差異，這意味著非維生素A源類胡蘿卜素化合物可能會在成骨細胞膜上與某一特異性受體識別結(jié)合，進入細胞代

10、謝途徑，激活或抑制某些關(guān)鍵性基因，對成骨細胞增殖與分化過程產(chǎn)生影響。同時由于3種類胡蘿卜素吸收與維生素D吸收對于RXR受體不存在競爭，因此其攝入可能不會導(dǎo)致后者吸收障礙。
　　 （3）分子水平：制備得到的β，β-胡蘿卜素、蝦青素、番茄紅素、斑蝥黃質(zhì)、玉米黃素、葉黃素反式單體以及體外碘誘導(dǎo)下得到的不同順式異構(gòu)體對不同自由基（O2-、OH-、1O2）均有良好的淬滅效果，但就淬滅自由基類型而言：1O2>OH。>O2-；就類胡蘿卜素反式

11、單體淬滅能力而言：番茄紅素>蝦青素>斑蝥黃質(zhì)>葉黃素>玉米黃素>β，β-胡蘿卜素；就類胡蘿卜素順/反式單體淬滅能力而言：類胡蘿卜素反式單體>13-順式異構(gòu)體>11-順式異構(gòu)體>9-順式異構(gòu)體。
　　 此外，在體外不同類胡蘿卜素對成骨細胞DNA的復(fù)制具有一定的促進作用，同時可有效地減低自由基對DNA的損傷影響。
　　 結(jié)論：
　　 （1）成功制備得到6種不同類胡蘿卜素的順/反式單體（2）成功建立一套整體、細胞、分子