層層自組裝技術(shù)在聚乳酸及鈦材表面工程的應(yīng)用.pdf

1、生物材料的表面性質(zhì)對于調(diào)控細(xì)胞與材料間的相互作用，包括細(xì)胞在生物材料表面粘附、遷移及分化等生物學(xué)行為具有至關(guān)重要的作用。從某種意義上講，生物材料界面就是材料與生命之間的紐帶。如何進(jìn)行生物材料表面功能化、進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞生理功能，對生物材料的研究/設(shè)計提出了更高的要求。隨著生物材料的發(fā)展，新型生物材料的設(shè)計被期望具有在分子水平刺激特異性細(xì)胞/基因響應(yīng)的能力，達(dá)到界面調(diào)控細(xì)胞命運的目的。
　　 在過去幾十年，聚乳酸及鈦材作為植入體，被廣

2、泛地應(yīng)用于臨床治療。然而，聚乳酸及鈦材自身生物相容性差，缺乏誘導(dǎo)組織形成性能，是其臨床應(yīng)用面臨的普遍挑戰(zhàn)。很多諸如感染、移位、異體反應(yīng)、纖維包囊及植入體與骨組織界面的細(xì)胞死亡等因素都可能導(dǎo)致植入失敗?；诰廴樗峒扳伈乃嬖诘膯栴}，為了實現(xiàn)界面調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為，誘導(dǎo)損傷組織的修復(fù)，急需發(fā)展新的研究思路及技術(shù)手段。層層自組裝技術(shù)(Layer-by-Layer assembly technique，LBL)是基于靜電相吸而形成多層膜自組裝體

3、系的技術(shù)，是一種簡單而又高效地構(gòu)建生物活性表面的方法。本論文利用層層自組裝技術(shù)并結(jié)合基因釋放/治療，在聚乳酸及鈦材表面構(gòu)建生物活性界面及細(xì)胞響應(yīng)性儲存器系統(tǒng)，目的是改善材料界面的細(xì)胞誘導(dǎo)性能，為開發(fā)新型聚乳酸及鈦材骨植入體奠定基礎(chǔ)。本文的主要研究內(nèi)容和結(jié)論如下：
　　 1.利用層層自組裝技術(shù)在聚乳酸表面構(gòu)建殼聚糖(Chi)/DNA多層膜結(jié)構(gòu)，并建立DNA釋放模型。
　　 用紅外光譜(FITR)、X光電子能譜(XPS)、原

4、子力顯微鏡(AFM)以及接觸角測試儀表征多層膜的沉積過程。接觸角測試表明：從第五層起，Chi/DNA層狀結(jié)構(gòu)開始形成。XPS及AFM分別證實了最外層組分決定了多層膜表面的化學(xué)性質(zhì)和表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。DNA釋放行為顯示在溶菌酶的存在下，DNA在32小時內(nèi)可緩慢釋放到溶液中。
　　 2.利用層層自組裝技術(shù)構(gòu)建基因功能化聚乳酸表面調(diào)控細(xì)胞特異性/非特異性轉(zhuǎn)染及機理研究。
　　 本研究首先合成了三種不同的聚合物，即半乳糖苷化殼聚糖(

5、galactosylated chitosan，GC)、半乳糖苷化聚乙烯亞胺(galactosylated polyethylenimine，GP)及環(huán)糊精接枝的聚乙烯亞胺(cyclodextrin grafted polyethylenimine，PEI-CD)。利用層層自組裝技術(shù)，將三種聚合物作為聚陽離子在聚乳酸表面構(gòu)建含質(zhì)粒DNA(pDNA)的多層膜。接觸角測試和原子力顯微鏡表征了GC/pDNA多層膜的組裝過程，結(jié)果表明從第四層開

6、始完整的單層膜開始形成。pDNA可從PDLLA/PEI/(pDNA/GC)5/pDNA多層膜持續(xù)釋放42小時以上。GC/DNA多層膜修飾的PDLLA基材有利于細(xì)胞的生長，而且經(jīng)過半乳糖接枝的殼聚糖或聚乙烯亞胺能夠通過受體介導(dǎo)的細(xì)胞胞吞途徑提高基因轉(zhuǎn)染率，實現(xiàn)界面介導(dǎo)的細(xì)胞特異性基因原位轉(zhuǎn)染。同時，PDLLA/(PEI-CD/pDNA)6多層膜系統(tǒng)也證實了界面調(diào)控細(xì)胞非特異性基因原位轉(zhuǎn)染的可行性。TEM觀察及抗DNA酶作用的結(jié)果表明材料表

7、面介導(dǎo)基因原位轉(zhuǎn)染的機制為：伴隨多層結(jié)構(gòu)膜降解，原位形成了質(zhì)粒DNA復(fù)合物顆粒，培養(yǎng)在多層結(jié)構(gòu)膜上的細(xì)胞原位吞噬該顆粒，實現(xiàn)了原位基因轉(zhuǎn)染。
　　 3.利用層層自組裝技術(shù)在鈦材表面構(gòu)建基因活化界面，調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的原位分化。
　　 為了進(jìn)一步研究界面調(diào)控基因轉(zhuǎn)染機制，利用層層自組裝技術(shù)在鈦膜表面構(gòu)建質(zhì)粒DNA/殼聚糖多層膜，考察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化行為。質(zhì)粒pEGFP-hBMP2(pGB)能表達(dá)綠色熒

8、光蛋白GFP及骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP2。隨著多層膜降解，質(zhì)粒DNA復(fù)合物顆粒從多層膜中持續(xù)形成，進(jìn)而原位轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。GFP、hBMP2 mRNA、堿性磷酸酶及骨鈣素的表達(dá)證實了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及向成骨細(xì)胞的分化，實現(xiàn)了基因活化鈦材表面誘導(dǎo)干細(xì)胞原位分化。
　　 4.利用層層自組裝技術(shù)在鈦材表面構(gòu)建殼聚糖、絲素蛋白多層膜并考察多層膜對成骨細(xì)胞生長行為的影響。
　　 用層層自組裝技術(shù)在鈦膜表面構(gòu)建殼聚糖/絲素蛋

9、白、殼聚糖/聚苯乙烯磺酸鈉類細(xì)胞外基質(zhì)多層膜結(jié)構(gòu)。接觸角結(jié)果表明從第五層起，Chi/SF及Chi/PSS層狀結(jié)構(gòu)均開始形成。XPS及AFM分別證實了最外層組分決定了多層膜表面的化學(xué)性質(zhì)和表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。成骨細(xì)胞增殖、活性、堿性磷酸酶表達(dá)及DNA總含量的檢測結(jié)果表明Chi/SF及Chi/PSS多層膜涂層的鈦膜具有較好的生物相容性，能促進(jìn)骨的形成。
　　 5.利用層層自組裝技術(shù)在鈦材表面構(gòu)建納米存儲器，調(diào)控骨的動態(tài)平衡。
　　

10、 運用層層自組裝技術(shù)將載藥介孔硅納米顆粒組裝到鈦材表面。介孔硅作為納米存儲器儲存β-雌二醇。主要考察了鈦材表面納米存儲器的組裝過程及細(xì)胞在該鈦材表面的生物學(xué)響應(yīng)行為。TGA分析顯示β-雌二醇通過簡單的擴散平衡可以負(fù)載到介孔硅中。Zeta電位檢測結(jié)果表明在MSN表面成功構(gòu)建殼聚糖(Chi)/明膠(Gel)多層膜，即E2-MSN@PEM。掃描電鏡觀察反映出E2-MSN@PEM納米顆粒被成功組裝到鈦膜表面，即激素功能化鈦材或雜化膜修飾的鈦材。

11、成骨細(xì)胞堿性磷酸酶的活性、礦化能力及OPG、OPN mRNA的表達(dá)驗證該系統(tǒng)具有良好的細(xì)胞相容性及誘導(dǎo)骨形成性能。同時，該系統(tǒng)還有抑制破骨細(xì)胞功能表達(dá)的能力，及調(diào)控成骨細(xì)胞/破骨細(xì)胞動態(tài)平衡，為骨質(zhì)疏松病患接受骨植入體治療提供了新思路。
　　 6.利用層層自組裝技術(shù)構(gòu)建細(xì)胞因子活化TiO2納米管調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移及分化。
　　 運用旋轉(zhuǎn)涂布層層自組裝技構(gòu)建細(xì)胞因子活化的TiO2納米管。首先用陽極氧化法制備TiO2

12、納米管，作為細(xì)胞因子BMP2納米存儲器。在負(fù)載BMP2的TiO2納米管表面構(gòu)建殼聚糖(Chi)/明膠(Gel)，即TiO2/BMP2/LBL。掃描電鏡觀察及接觸角結(jié)果表明運用旋轉(zhuǎn)涂布層層自組裝技術(shù)可在TiO2/BMP2構(gòu)建Chi/Gel多層膜保護(hù)層。SOD活性檢測表明Chi/Gel多層膜可以保護(hù)SOD的活性，延長其使用壽命。與其它TiO2樣本相比較，TiO2/BMP2/LBL體系更有利于促進(jìn)MSCs的遷移及分化。
　　 7.利用

13、層層自組裝技術(shù)構(gòu)建骨細(xì)胞微環(huán)境調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化及促進(jìn)體內(nèi)骨生成。
　　 運用層層自組裝技術(shù)構(gòu)建具有骨誘導(dǎo)性能的生物功能化、多層膜覆蓋的TC4植入體，及TC4/LbL/BMP2/FN系統(tǒng)。隨著多層膜的降解，BMP2長時間內(nèi)持續(xù)釋放。ALP的表達(dá)，細(xì)胞礦化及成骨細(xì)胞基因(Runx2，Osterix，OCN，OPN，ALP andCol I)的檢測結(jié)果表明多層膜結(jié)構(gòu)可促進(jìn)體外MSCs的粘附及分化。體內(nèi)Micro-CT及組織學(xué)