草坪草抗旱生理及相關(guān)基因的分析.pdf

1、干旱脅迫可造成植物在形態(tài)、生理、蛋白及基因表達(dá)等水平上的變化,是限制植物生長(zhǎng)的主要環(huán)境因子之一。研究植物抗旱機(jī)理以及植物對(duì)干旱的適應(yīng)和調(diào)節(jié)機(jī)制,對(duì)選育高效抗旱新品種,解決當(dāng)前水資源短缺和生態(tài)環(huán)境惡化具有重要意義。本文首先以狗牙根為材料,對(duì)8個(gè)狗牙根基因型進(jìn)行了抗旱性能評(píng)價(jià)與篩選；并以所篩選出的抗旱性差異較大的兩個(gè)狗牙根品種-Tifway(抗旱)和C299(不抗旱),探討了草坪草對(duì)干旱脅迫的光合生理反應(yīng)；論文還以兩個(gè)抗旱差異較大的草地早熟

2、禾品種-Midnight(抗旱)和Brilliant(不抗旱)為材料,探討對(duì)干旱脅迫的光合生理反應(yīng)、干旱脅迫后復(fù)水過(guò)程中CTKs和。KCl對(duì)草地早熟禾葉片氣孔開(kāi)度及光合作用的影響,并以草地早熟禾抗旱型品種為材料,通過(guò)SSH技術(shù)構(gòu)建了干旱脅迫下草地早熟禾葉片消減cDNA文庫(kù),經(jīng)陽(yáng)性克隆測(cè)序、同源性比對(duì)、功能分類及RT-PCR分析,獲得了大量與抗旱相關(guān)的候選基因片段。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:
　　 1.不同基因型狗牙根抗旱性能的生理

3、評(píng)價(jià)
　　 SDS-PAGE分析表明,在輕度(6 d)到中度(10 d)干旱脅迫下,8個(gè)基因型的狗牙根葉片可溶性蛋白沒(méi)有明顯的變化。重度干旱脅迫(14 d)造成狗牙根葉片中可溶性蛋白降解,其中以C299和Tifeagle降解最為嚴(yán)重。免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn),正常澆水下狗牙根葉片沒(méi)有脫水素蛋白的表達(dá)。干旱脅迫6 d時(shí),只有一條24 kDa分子量的脫水素在C299中表達(dá)。干旱脅迫第10 d時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)了6條不同分子量的脫水素蛋白,其中14-

4、、19-和24 kDa分子量的脫水素蛋白在8個(gè)狗牙根基因型中均表達(dá),但是在C299、Tifeagle和Tifdwarf中的表達(dá)量均高于其它5個(gè)狗牙根基因型。31 kDa分子量的脫水素蛋白只在Tifway和H19中表達(dá),其它6個(gè)基因型均沒(méi)有表達(dá)。40 kDa分子量的脫水素蛋白在8個(gè)狗牙根基因型中均有表達(dá),但是在Tifway、H19和H10中的表達(dá)量均高于其它5個(gè)基因型。以草坪外觀質(zhì)量(TQ)、葉片相對(duì)含水量(RWC)、相對(duì)電導(dǎo)率(EL)并

5、結(jié)合可溶性蛋白圖譜的變化與脫水素蛋白的表達(dá)為指標(biāo),綜合評(píng)價(jià)了試驗(yàn)中8個(gè)狗牙根型的抗旱性能,可將試驗(yàn)中8個(gè)狗牙根基因型抗旱性大小排序?yàn)?(Tifway、H19)>(H10、Kan1、Sportbermuda、Tifdwarf)>(Tifeagle、C299)。
　　 2.不同抗旱性狗牙根品種離體葉片失水率及其脫水素蛋白表達(dá)的差異
　　 抗旱品種Tifway和水分敏感品種C299葉片離體失水速度不同,Tifway的離體葉片失

6、水率(RWL)顯著低于C299。脫水至同一失水量如10％、30％、50％和65％,Tifway則需要更長(zhǎng)的時(shí)間。葉片失水誘導(dǎo)了不同分子量脫水素蛋白的表達(dá),74kDa分子量的脫水素蛋白在不同失水量和在兩個(gè)狗牙根基因型中表達(dá)量沒(méi)有顯著差異；14-、19-和24 kDa分子量的脫水素蛋白其表達(dá)從失水10％到65％,均隨著脫水量的增加而增加,在同一失水量下,其在C299中的表達(dá)量高于Tifway。31 kDa分子量的脫水素蛋白只在Tifway中

7、表達(dá)而不在C299中表達(dá),且其表達(dá)量隨著失水量的增加而增加。從失水量10％到65％,40 kDa分子量的脫水素蛋白其表達(dá)量隨著脫水量的增加而增加,在同一失水量下,其在Tifway中的表達(dá)量顯著高于C299。
　　 3.干旱脅迫下不同抗旱性狗牙根品種的光合生理差異
　　 在輕度水分脅迫下(6 d),PSⅡ活性在C299和Tifway中均沒(méi)有下降；當(dāng)干旱脅迫到10 d和14 d時(shí),C299和Tifway的Fv/Fm顯著下降,

8、且C299顯著低于Tifway；干旱脅迫下光合作用顯著降低,其中C299下降更快,在干旱脅迫第6、10和14 d時(shí)Tifway的Pn和gs顯著高于C299。
　　 Tifway的Rubisco活性和活化率從干旱脅迫第14 d才開(kāi)始下降,而C299則從干旱脅迫第10 d就開(kāi)始降低。此外,SDS-PAGE蛋白圖譜也顯示,與光合作用相關(guān)的主要蛋白如Rubisco大亞基(49 kDa)和磷酸丙酮酸二激酶(PPDK,98 kDa)從干旱脅

9、迫第14 d開(kāi)始在C299葉片中急劇降解,而在Tifway中沒(méi)有降解。
　　 4.干旱脅迫及復(fù)水對(duì)草地早熟禾光合生理特性的影響
　　 在短期或輕度水分脅迫條件下(5 d),草地早熟禾葉片的Fv/Fm和其它的光合組分(Rubisco活性及活化率、Pnmax、CE、Vcmax、Jmax)均沒(méi)有下降或有小幅降低,而Pn則伴隨著gs、Tr和gm的下降而降低,并且Brilliant比Midnight下降速度快。在中度(10 d)到

10、重度(15 d)干旱脅迫下,Rubisco活性及活化率、CE、Fv/Fm、Vcmax、Jmax等均顯著下降,并且Brilliant比Midnight下降更劇烈。干旱脅迫解除后,草地早熟禾抗旱品種Midnight葉片的光合參數(shù)如Vcmax、Jmax、CE、Pnmax中均恢復(fù)到或接近對(duì)照水平,但在不抗旱品種Brilliant中均顯著低于對(duì)照水平,而gs及Pn在兩個(gè)品種中均未能恢復(fù)到對(duì)照水平。
　　 5.干旱脅迫后復(fù)水CTKs和KCl

11、對(duì)草地早熟禾葉片氣孔開(kāi)度及光合作用的影響
　　 離體葉片脫水后復(fù)水,10μM的6-benzylaminopurine(6-BA)和50 mM的KCl溶液對(duì)誘導(dǎo)草地早熟禾離體葉片的氣孔再開(kāi)放效果最佳。草地早熟禾葉片氣體交換值(Pn、gs、Tr)及氣孔開(kāi)度均隨著土壤含水量和葉片相對(duì)含水量的下降而降低。干旱脅迫后復(fù)水,經(jīng)6-BA或KCl處理過(guò)的植株其葉片氣孔開(kāi)度及氣體交換值(Pn、gs、Tr)均顯著高于未處理葉片。干旱脅迫及復(fù)水條件下

12、,葉片氣體交換值(Pn、gs、Tr)與葉片氣孔孔徑呈極顯著線性相關(guān)。
　　 6.干旱脅迫下草地早熟禾葉片差異表達(dá)基因的分離
　　 利用SSH技術(shù)構(gòu)建了干旱10 d草地早熟禾葉片消減cDNA文庫(kù)。通過(guò)測(cè)序后篩選,得到了503條高質(zhì)量的EST序列。序列組裝拼接后分別得到了387個(gè)Uni-ESTs,其中contigs239條和singlets148條。通過(guò)同源性比對(duì),獲得了156條與已知功能基因同源或相似的Uni-ESTs,1