滑膜細(xì)胞微環(huán)境對(duì)軟骨細(xì)胞生物學(xué)活性的影響.pdf

1、骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種好發(fā)于中老年人的慢性進(jìn)行性骨關(guān)節(jié)病。它是一種以軟骨退行性變?yōu)楹诵模奂肮琴|(zhì)，包括滑膜，關(guān)節(jié)囊及關(guān)節(jié)囊外其他結(jié)構(gòu)的不同程度的炎性病變。隨著我國(guó)人口老齡化和OA發(fā)病趨勢(shì)年輕化，OA逐漸成為危害人類(lèi)健康和生存質(zhì)量的重要疾病。對(duì)OA發(fā)生和發(fā)展機(jī)制的研究也已成為骨科領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。研究顯示無(wú)論何種原因引發(fā)的OA多伴有關(guān)節(jié)內(nèi)微環(huán)境失衡，滑膜及其細(xì)胞是其主要因素。
　　 目的：建立滑膜細(xì)胞

2、與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系，構(gòu)筑類(lèi)OA微環(huán)境，探討滑膜細(xì)胞在OA發(fā)生中的作用，為OA發(fā)病機(jī)理研究提供依據(jù)。
　　 方法：⑴采用改良的Hulth法復(fù)制兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型，切除內(nèi)側(cè)半月板，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶及前交叉韌帶，術(shù)后4周關(guān)節(jié)腫脹、滑膜增生明顯，獲得大量滑膜組織。⑵用胰蛋白酶-Ⅱ型膠原酶聯(lián)合酶消化法分離滑膜細(xì)胞進(jìn)行原代與傳代培養(yǎng)，觀察滑膜細(xì)胞形態(tài)、活性，進(jìn)行CD68免疫組化鑒定。⑶采用兩步酶消化法從正常兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織獲取軟骨細(xì)胞，

3、進(jìn)行原代、傳代培養(yǎng)及細(xì)胞學(xué)觀察；⑷建立滑膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系，將原代和傳代滑膜細(xì)胞分別以不同的比例(1:1，1:1/2，1:1/4，1:1/8)分別與軟骨細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)為4×104個(gè))共培養(yǎng)，以正常軟骨細(xì)胞組為對(duì)照組，觀察原代及傳代滑膜細(xì)胞微環(huán)境對(duì)軟骨細(xì)胞形態(tài)及生物學(xué)活性的影響。⑸采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)方法檢測(cè)共培養(yǎng)10

4、天和20天時(shí)原代及傳代滑膜細(xì)胞微環(huán)境對(duì)各組軟骨細(xì)胞在RNA水平上，Ⅱ型膠原及蛋白多糖基因表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：①改良Hulth法復(fù)制膝骨性關(guān)節(jié)炎模型，造模4周關(guān)節(jié)腫脹，滑膜組織增生明顯，襯覆滑膜細(xì)胞層數(shù)增加，間質(zhì)纖維組織增生，軟骨表面裂隙或纖維化，軟骨細(xì)胞呈小灶性壞死。②胰蛋白酶-Ⅱ型膠原酶聯(lián)合酶消化法可培養(yǎng)獲得大量滑膜細(xì)胞且細(xì)胞活性大于98％，巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞CD68免疫組化染色陽(yáng)性。③胰蛋白酶-Ⅰ型膠原酶-Ⅱ型膠原酶聯(lián)

5、合酶消化法可成功分離并獲得大量高活性軟骨細(xì)胞。④以滑膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系構(gòu)筑了滑膜細(xì)胞微環(huán)境，滑膜細(xì)胞數(shù)量、培養(yǎng)時(shí)間與軟骨細(xì)胞形態(tài)及增殖活性密切相關(guān)，滑膜細(xì)胞數(shù)量越多、作用時(shí)間越長(zhǎng)，軟骨細(xì)胞增殖活性越低。⑤滑膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，滑膜細(xì)胞數(shù)量、代次與Ⅱ型膠原及蛋白多糖基因表達(dá)密切相關(guān)。共培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞基因表達(dá)明顯下調(diào)，原代滑膜細(xì)胞作用強(qiáng)于傳代滑膜細(xì)胞；滑膜細(xì)胞數(shù)量越高，軟骨細(xì)胞基因表達(dá)越低。
　　 結(jié)論：⑴改良Hu

6、lth造模法可迅速形成骨性關(guān)節(jié)炎，使滑膜組織在短時(shí)間內(nèi)增生明顯，襯覆滑膜細(xì)胞層數(shù)增加，間質(zhì)纖維組織增生，獲得大量的滑膜組織，解決了滑膜取材難的問(wèn)題。該法適用于提取滑膜組織和OA發(fā)病機(jī)制的研究。⑵聯(lián)合酶消化法可分離獲取滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、快捷，細(xì)胞貼壁快且細(xì)胞活性率較高，可在短時(shí)間內(nèi)為實(shí)驗(yàn)研究提供大量目標(biāo)細(xì)胞，為實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步研究提供了方便。⑶構(gòu)筑的滑膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系適用于OA微環(huán)境的研究，且該體系可模擬類(lèi)OA關(guān)節(jié)內(nèi)