鉤端螺旋體M23金屬內(nèi)肽酶活性與致病性研究及流感嗜血桿菌OMP6優(yōu)勢抗原表位篩選與鑒定.pdf

1、本文分為以下兩個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分 鉤端螺旋體M23超家族金屬內(nèi)肽酶活性及致病性研究
　　背景及意義:鉤端螺旋體(以下簡稱鉤體)病是由致病性鉤體感染引起的自然疫源性人畜共患傳染病，也是我國重點(diǎn)防疫和監(jiān)控的主要傳染病之一。根據(jù)致病性可將鉤體分為致病性和非致病性兩大類，問號(hào)鉤體(Leptospira interrogans)是流行最廣的致病性鉤體基因種，我國則以問號(hào)鉤體黃疸出血群賴型為優(yōu)勢流行的血清群型。致病性鉤體具有

2、強(qiáng)大的侵襲力，能迅速穿越皮膚和黏膜侵入人體，也能從血流中穿越血管壁擴(kuò)散多種臟器和組織，但其侵襲力的物質(zhì)基礎(chǔ)及機(jī)制迄今未完全明了。金屬蛋白酶(metalloprotease，MP)是一群能水解蛋白或多肽的酶類，問號(hào)鉤體黃疸出血群賴型賴株基因組中具有多個(gè)產(chǎn)物注釋為MP的基因，但其酶活性和致病作用尚無報(bào)道。
　　方法:采用生物信息學(xué)軟件分析問號(hào)鉤體黃疸出血群賴型賴株LA2582和LA2901基因產(chǎn)物信號(hào)肽、跨膜區(qū)和功能結(jié)構(gòu)域。構(gòu)建LA2

3、582和LA2901基因胞外區(qū)原核表達(dá)系統(tǒng)，采用Ni-NTA親和層析法提純目的重組表達(dá)產(chǎn)物rLA2582和rLA2901，采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝膠圖像分析系統(tǒng)檢測其表達(dá)及提純效果。提純的rLA2582和rLA2901皮內(nèi)注射免疫家兔獲得抗血清及其IgG。采用分光光度儀檢測rLA2582和rLA2901水解Dabsyl-Leu-Gly-Gly-Gly-Ala-Edans熒光五肽底物的活性及其Km和Kcat值。采用SDS-P

4、AGE檢測rLA2582和rLA2901水解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)分子Ⅰ型膠原蛋白(COL1)和纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)的活性。采用分光光度法檢測rLA2582和rLA2901水解剛果紅標(biāo)記彈性蛋白(elastin，ELN)底物的活性。采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和Western Blot法，檢測問號(hào)鉤體賴株感染HUVEC人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后LA2582和LA2901基因mRNA

5、和蛋白表達(dá)水平及其產(chǎn)物外分泌情況。
　　結(jié)果:生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，LA2582和LA2901基因產(chǎn)物均有信號(hào)肽和跨膜區(qū)，其氨基酸序列中含有鋅離子依賴M23超家族金屬Gly-Gly內(nèi)肽酶的功能結(jié)構(gòu)域和M23基序HXH。所構(gòu)建的問號(hào)鉤體賴株LA2582或LA2901基因原核表達(dá)系統(tǒng)能有效地表達(dá)目的重組蛋白rLA2582或rLA2901。rLA2582和rLA2901均能水解Dabsyl-Leu-Gly-Gly-Gly-Ala-Ed

6、ans熒光五肽底物，其Km和Kcat值分別為126.54μmol·L-1和4.67s-1、190.25μmol·L-1和4.85s-1。rLA2582和rLA2901能水解ECM分子COL1、FN和ELN。問號(hào)鉤體賴株感染HUVEC人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后，其LA2582和LA2901基因mRNA、蛋白表達(dá)和外分泌水平均顯著增高(p＜0.05)。
　　結(jié)論:問號(hào)鉤體賴株LA2582和LA2901基因產(chǎn)物是具有水解多種ECM分子活性的鋅離

7、子依賴M23金屬內(nèi)肽酶，與問號(hào)鉤體侵襲力密切相關(guān)。
　　第二部分 不可分型流感嗜血桿菌OMP6優(yōu)勢抗原袁位篩選與鑒定
　　背景及意義:流感嗜血桿菌感染常引起兒童肺炎、中耳炎和腦膜炎、等疾病。根據(jù)有無英膜及其多糖抗原，流感嗜血桿菌可分為能用血清學(xué)試驗(yàn)分型的可分型流感嗜血桿菌(typeable Haemophilus influenzae，THi)和不可分型流感嗜血桿菌(nontypeable Haemophilus influ

8、enzae，NTHi)。接種多價(jià)流感嗜血桿菌英膜多糖疫苗有效地預(yù)防了THi的感染，但該疫苗對(duì)NTHi無效。因此，篩選與鑒定NTHi外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)及其優(yōu)勢T和B細(xì)胞(T-B)聯(lián)合抗原表位，可為研發(fā)NTHi抗原肽疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　方法:采用PCR擴(kuò)增NTHi臨床菌株全長omp6基因，T-A克隆后測序。采用生物信息學(xué)軟件分析OMP6序列保守性與膜定位并預(yù)測其T-B聯(lián)合抗原表位。采用噬菌

9、體展示聯(lián)合免疫印跡法和ELISA檢測重組噬菌體PⅢ蛋白(rPⅢ)展示的OMP6中T-B聯(lián)合抗原表位肽免疫原性和免疫反應(yīng)性。
　　結(jié)果:35株NTHi臨床菌株均能檢出omp6基因，其核苷酸和氨基酸序列相似性分別為98.3％～100％和99.3％～100％。OMP6為外膜表面蛋白，具有OMP6-2-25、OMP6-61-86和OMP6-98-126三個(gè)高分的預(yù)測T-B聯(lián)合抗原表位。Western Blot和ELISA結(jié)果顯示，OMP6