問號鉤端螺旋體鞭毛相關(guān)fliN基因靶向敲除及其突變株致病性變化.pdf

1、背景和目的：問號鉤端螺旋體(簡稱鉤體)感染引起的鉤體病是全球流行的自然疫源性人獸共患傳染病，其致病機(jī)制至今不明。研究結(jié)果顯示，不同毒力的問號鉤體均能以菌體一端或兩端粘附宿主細(xì)胞，而此處正是相當(dāng)于細(xì)菌鞭毛基礎(chǔ)小體的鉤體鞭毛終結(jié)結(jié)構(gòu)所在部位。細(xì)菌鞭毛基礎(chǔ)小體含有Ⅲ型分泌系統(tǒng)，不僅承擔(dān)細(xì)菌分裂后鞭毛生長時(shí)鞭毛蛋白的輸出，一些與細(xì)菌粘附、侵襲和毒性相關(guān)因子也通過T3SS釋放。問號鉤體fliN基因雖被注釋為鞭毛馬達(dá)開關(guān)蛋白，但其序列中有與大腸桿菌

2、fliN基因、鼠疫耶爾森菌yscQ基因相似的共同基序Pf:spoA。大腸桿菌fliN基因?qū)儆赥3SS，其產(chǎn)物在細(xì)菌粘附及侵入細(xì)胞過程中有重要作用。YscQ也是耶爾森菌T3SS中與侵襲力相關(guān)的毒力蛋白。因此，問號鉤體fliN也極有可能具有與大腸桿菌fliN和耶爾森菌YscQ相似的功能。本研究采用基因敲除技術(shù)構(gòu)建了fliN基因失活的問號鉤體突變株，通過比較野生株和突變株動(dòng)力以及分泌毒性物質(zhì)、黏附細(xì)胞、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力的差異，對問號鉤體fli

3、N基因的致病機(jī)制進(jìn)行了研究。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：構(gòu)建基因打靶載體p2NILfliN-amp，采用基于自殺質(zhì)粒與染色體同源序列重組的靶基因敲除技術(shù)構(gòu)建不表達(dá)fliN的問號鉤體賴型56601株突變株，采用PCR、測序和Western Blot對fliN-突變株進(jìn)行鑒定。采用動(dòng)力試驗(yàn)、MTT、Fontana鍍銀染色法和流式細(xì)胞術(shù)，對fliN-突變株的遷移能力、培養(yǎng)物上清對小鼠單核-巨噬樣細(xì)胞株J774A.1的細(xì)胞毒性、黏附及誘導(dǎo)J774

4、A.1細(xì)胞凋亡能力的改變進(jìn)行研究。
　　 結(jié)果：PCR、測序和Western blot結(jié)果均證實(shí)成功構(gòu)建了fliN-突變株，該突變株能在含100μg/ml氨芐青霉素的Korthof培養(yǎng)基中生長及繁殖。fliN-突變株在Korthof伴固體培養(yǎng)基上菌落直徑(2～3 mm)明顯小于野生株(6～8 mm)，表明該突變株動(dòng)力消失。fliN-突變株培養(yǎng)物上清作用J774A.1細(xì)胞72h時(shí)雖顯示有細(xì)胞毒性，但明顯低于野生株(P<0.05)。