玉米淀粉合成調(diào)控基因的挖掘及功能分析.pdf

1、玉米是全世界種植最廣泛的作物，同時也是近十年來年產(chǎn)量高的谷類作物，高于水稻和小麥，在人類的各類生產(chǎn)生活中扮演著越來越重要的角色，它不僅是主要的糧飼作物，更是各類生產(chǎn)中主要的淀粉來源，淀粉根據(jù)結(jié)構(gòu)不同分為直鏈淀粉和支鏈淀粉，高直低支或高支低直的淀粉在各領域中分別發(fā)揮著重要的作用。普通玉米中直鏈淀粉的含量一般約為25％，支鏈淀粉約為75%，如何調(diào)節(jié)和改善直鏈和支鏈淀粉含量的平衡度，需要深入開展對淀粉生物代謝途徑的研究，不僅對完善淀粉代謝途徑

2、有重要的理論意義，而且對有效的控制淀粉合成途徑改善淀粉含量和品質(zhì)具有重要的實踐意義。本實驗通過基因組關(guān)聯(lián)分析的方法篩選出與淀粉合成相關(guān)的基因，對這些基因的進行了表達模式分析。對ZM-LEGF基因啟動子進行功能分析，并通過過量表達技術(shù)對玉米ZmbZIP91基因在淀粉合成代謝途徑中的功能以及作用機制進行了研究，共獲得以下主要成果：
　?。?）通過直鏈淀粉和總淀粉的極端性狀與87份重測序材料的SNP數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析和直鏈淀粉和總淀粉形狀與轉(zhuǎn)

3、錄組測序篩選得到的36個轉(zhuǎn)錄因子候選基因關(guān)聯(lián)分析，共篩選得到了7個相關(guān)基因，并對其中6個基因做了表達模式分析其中4個基因在胚乳中特異性表達。
　?。?）對通過GUS組織化學染色和GUS熒光定量對玉米ZM-LEGF基因啟動子以及篩選片段的功能進行分析發(fā)現(xiàn)，隨著啟動子的序列變短，驅(qū)動GUS基因表達的位置和活性都發(fā)現(xiàn)變化；位于-140~+41區(qū)域?qū)幼域?qū)動基因表達的一段關(guān)鍵性序列；該功能最強的啟動子活性元件位于-273~-140區(qū)域中

4、，即pZM-LEG6。我們又進一步對pZM-LEG6 T2代轉(zhuǎn)基因水稻的不同發(fā)育階段的組織進行GUS染色分析，發(fā)現(xiàn)該啟動子只在營養(yǎng)器官中表達，不在種子中表達。
　?。?）亞細胞定位實驗發(fā)現(xiàn)，ZmbZIP91基因與 GFP融合表達蛋白定位在 P小體中，且通過在線網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)，該基因無核定位序列也無信號肽，說明該基因無法入核表達，不能正常的參與對功能基因的表達調(diào)控；酵母單雜實驗結(jié)果顯示，玉米ZmbZIP91基因能與已知玉米淀粉合成相關(guān)

5、基因ZmAGPL1、ZmBEIIa、pZmISA2、ZmSSIV、ZmGBSSIIb和ZmSSI相互作用，表明該基因可能參與淀粉合成過程。
　?。?）過量表達玉米 ZmbZIP91基因后的轉(zhuǎn)基因水稻株，除籽粒有變化外，其他表現(xiàn)沒有明顯差異。對水稻17個淀粉合成相關(guān)基因分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因種子的表達量總體低于野生型；對籽粒外部表型進行研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株的籽粒的長度幾乎不變，而寬度明顯小于野生型和空載體，較野生型降低了12.28%，千粒

6、重隨之也小于野生型和空載體，較野生型降低了16.16%；對籽粒淀粉含量分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因種子的總淀粉含量明顯低于野生型和空載體，較野生型最大均差值達6.96%；直鏈淀粉含量較野生型和空載體低，較野生型最大均差值為21.83%；對籽粒淀粉結(jié)構(gòu)分析顯示，石蠟切片下觀察，野生型與轉(zhuǎn)ZmbZIP91基因種子在可見光下沒有發(fā)現(xiàn)有明顯的差異轉(zhuǎn)基因種子，而在紫外光下，轉(zhuǎn)基因種子的淀粉發(fā)出黃色的亮光，野生型幾乎沒有。掃描電鏡下觀察，轉(zhuǎn)ZmbZIP91基因

7、種子在中部、腹部、和背部這三個部位的淀粉顆粒都明顯小于野生型和空載體。表明ZmbZIP91基因可能在水稻淀粉合成過程中起著負調(diào)控作用。
　　（5）對轉(zhuǎn)ZmbZIP91基因株的突變型株（m-91）的性狀分析結(jié)果顯示：m-91突變型株的穗長、花藥、子房、穎殼、穎毛以及籽粒明顯大于野生型，且稃尖增長尤為明顯，較野生型平均增加了45.07%；對長和寬比較分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因的籽粒的長顯著高于野生型，寬度稍大于野生型，分別增加了22.01%和8

8、.12%；對千粒重分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因種子的較野生型高，平均增加了22.99%；對去殼的種子外形以及種子淀粉結(jié)構(gòu)進行掃描電鏡分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因種子表皮出現(xiàn)褶皺，與胚乳分離，中心部位出現(xiàn)堊白現(xiàn)象，淀粉粒呈多面體，大部分淀粉粒和蛋白體松散的排列，少量淀粉粒形成復合體呈球形鑲嵌在松散的淀粉粒和蛋白體中；對種子的總淀粉和直鏈淀粉結(jié)構(gòu)進行測定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因直鏈淀粉含量較野生型相比降低了24.25%，而總淀粉含量變化微弱，僅為2.95%。結(jié)果表明Zmb