玉米葡聚糖酶基因ZmEXGA的克隆及初步功能分析.pdf

1、本研究在課題組利用iTRAQ技術(shù)分別構(gòu)建大粒馬齒型玉米自交系丹232和小粒爆裂玉米自交系N04不同發(fā)育時(shí)期果皮和胚乳差異表達(dá)蛋白庫(kù)的基礎(chǔ)上，挑選功能預(yù)測(cè)為外切葡聚糖酶轉(zhuǎn)氨酶的差異表達(dá)蛋白，克隆了兩個(gè)自交系外切葡聚糖酶轉(zhuǎn)氨酶基因ZmEXGA的全長(zhǎng)cDNA序列及其DNA序列，并進(jìn)行了功能預(yù)測(cè)、不同發(fā)育時(shí)期果皮和胚乳表達(dá)分析，以及亞細(xì)胞定位。同時(shí)構(gòu)建了該基因的超表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)擬南芥篩選出T1代陽(yáng)性植株，為進(jìn)一步深入研究該基因在玉米籽粒發(fā)育過(guò)程

2、中的功能奠定了基礎(chǔ)。
　　主要研究結(jié)果如下：
　　1.從iTRAQ蛋白庫(kù)中選取玉米自交系N04授粉后20 d果皮表達(dá)量較自交系丹232高3倍、初步預(yù)測(cè)功能為外切葡聚糖酶轉(zhuǎn)氨酶的一條肽段，利用電子延伸和RT-PCR方法成功克隆了兩個(gè)玉米自交系外切葡聚糖酶轉(zhuǎn)氨酶基因ZmEXGA的全長(zhǎng)cDNA和DNA序列。兩個(gè)自交系該基因的全長(zhǎng)cDNA序列為2138 bp，編碼區(qū)為1866 bp，編碼622個(gè)氨基酸，5’非編碼區(qū)為23 bp，3’

3、非編碼區(qū)為250 bp。兩個(gè)自交系ZmEXGA基因的DNA序列為5529 bp和5622 bp。兩個(gè)自交系間ORF存在11個(gè)堿基差異，其中1個(gè)堿基差異引起編碼氨基酸由丙氨酸變?yōu)樘K氨酸。兩個(gè)自交系間DNA序列在啟動(dòng)子區(qū)域存在較大差異，自交系N04相比丹232含有6個(gè)長(zhǎng)短不一的缺失片段及16個(gè)SNP差異。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示，該基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)域?qū)儆谔擒账饷傅谌易錑H3，同時(shí)對(duì)其編碼蛋白的理化性質(zhì)及二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。
　　

4、2.系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，ZmEXGA基因編碼的蛋白質(zhì)與谷子具有較高的同源性（93％），與擬南芥的同源性為77%。通過(guò)ZmEXGA基因編碼序列（CDS）序列與B73(B73 RefGen)比對(duì)，推測(cè)該基因?yàn)閱慰截?，可能位于玉米?染色體上。
　　3.采用熒光定量PCR方法對(duì)ZmEXGA基因在兩個(gè)自交系丹232和N04不同籽粒發(fā)育時(shí)期（10DAP、20DAP、33DAP和46DAP）果皮和胚乳中的表達(dá)分析結(jié)果表明，該基因在果皮中表達(dá)量均

5、高于胚乳，且以丹232的10DAP果皮表達(dá)量最高，與該基因的蛋白表達(dá)結(jié)果比較，除自交系N04果皮外，其趨勢(shì)基本一致。
　　4.利用ZmEXGA基因和經(jīng)過(guò)改造添加了GFP元件的表達(dá)載體P-Super1300構(gòu)造融合表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)入洋蔥表皮瞬時(shí)表達(dá)進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示，該基因主要在細(xì)胞膜或細(xì)胞膜壁上表達(dá)。該結(jié)果與利用PSORT II預(yù)測(cè)結(jié)果相一致。
　　5.選用超表達(dá)載體pCAMBIA1304構(gòu)建ZmEXG