RNA干擾特異性阻斷胰島局部RAS對胰高血糖素分泌功能的影響及其機制.pdf

1、本研究利用db/db小鼠為研究對象，觀察其胰島局部AT1R的表達，通過腺病毒介導RNA干擾（RNAinterference，RNAi）特異性抑制胰島局部AT1R的表達，觀察其對胰島素相關信號通路分子表達的影響，并利用胰島灌流評估其胰高血糖素及胰島素動態(tài)分泌功能，探討其可能的作用機制，進而揭示胰島局部RAS在內分泌胰腺中的作用及與2型糖尿病的關系，為尋找糖尿病防治藥物的新作用靶點拓展新思路。具體研究分為以下三個部分:
　　第一章 d

2、b/db糖尿病小鼠胰島局部血管緊張素Ⅱ1型受體的表達
　　目的：
　　觀察db/db小鼠胰島局部AT1R的表達，以進一步揭示胰島局部RAS在胰高血糖素分泌功能中的作用。
　　方法：
　　選取15只8周齡無特定病原體(SPF)級雌性C57BL/KsJ-db/db小鼠及15只同周齡同窩出生的C57BL/KsJ-db/m小鼠。分離培養(yǎng)db/db和db/m小鼠胰島，熒光實時定量PCR(qRT-PCR)及Westem bl

3、ot檢測AT1R mRNA和蛋白的表達。
　　結果：
　　db/db小鼠胰島AT1R mRNA及蛋白的表達水平均為db/m小鼠胰島的3倍左右，差異均有統(tǒng)計學意義[mRNA:（320-25）％vs(100±8)％，P＜0.05;蛋白:（310±20）％vs(100±8)％)，P＜0.05]。
　　結論：
　　db/db糖尿病小鼠胰島局部AT1R過度表達。
　　第二章 db/db糖尿病小鼠胰島局部AT1R基因R

4、NA干擾重組腺病毒的構建
　　目的：
　　構建AT1R基因靶向RNAi重組腺病毒，并在293包裝細胞中擴增制備重組病毒。
　　方法：
　　由生物公司合成針對db/db小鼠AT1R mRNA的特異性小分子干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）真核表達質粒psiRNA-AT1R;雙酶切得到 siRNA-AT1R表達片段;插入pAdTrack載體上，獲得轉移質粒pAdTrack-siRNA

5、-AT1R;后者經線性化處理后，轉化含有腺病毒骨架質粒pAdEasy-1的大腸桿菌BJ5183進行同源重組;PacⅠ酶切鑒定，篩選出正確重組腺病毒質粒pAdEasy-siRNA-AT1R;酶切線性化后轉染293細胞包裝成重組病毒Ad-siAT1R，熒光顯微鏡觀察綠色熒光表達，行PCR鑒定。通過反復感染擴增病毒，以氯化銫密度梯度離心法純化重組腺病毒。同法擴增空載病毒Ad-siControl至相當量，并純化。
　　結果：
　　P

6、acⅠ酶切鑒定證實重組腺病毒質粒pAdEasy-siRNA-AT1R構建成功:于熒光顯微鏡下觀察到pAdEasy-siRNA-AT1R轉染293細胞后有綠色熒光蛋白表達;PCR鑒定說明重組腺病毒中含siRNA-AT1R片斷，成功構建了攜帶含AT1R干擾RNA的重組腺病毒Ad-siAT1R，在293包裝細胞中擴增后，利用氯化銫梯度離心純化法獲得約3.6×109efu/ml滴度的重組腺病毒。
　　結論：
　　利用AdEasy-1

7、系統(tǒng)可快速高效制備表達AT1R干擾RNA的重組腺病毒，為進一步研究胰島局部RAS在胰高血糖素分泌功能中的作用奠定了基礎。
　　第三章 胰島灌流評估db/db小鼠胰島局部AT1R基因沉默后的胰高血糖素動態(tài)分泌功能
　　目的：
　　觀察AT1R基因靶向RNAi重組腺病毒對db/db小鼠胰島中AT1R表達以及IRS、PI3K調節(jié)亞基p85[PI3K(p85)]以及磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（p-Akt2）的表達，并利用離體

8、胰島灌流系統(tǒng)評估胰島素及胰高血糖素動態(tài)分泌情況，探討其可能的機制。
　　方法：
　　db/db小鼠胰島過夜培養(yǎng)，分為3組處理:Ad-siAT1R組，按MOI100，加入Ad-siAT1R病毒液，作用2小時，更換新培養(yǎng)液;空病毒組:以不表達任何目的基因的腺病毒Ad-siControl用相同的MOI感染;空白對照組:同等條件下培養(yǎng)但未行任何干預處理的胰島。胰島繼續(xù)培養(yǎng)48小時，此后檢測AT1R、IRS-1、IRS-2、P13K(

9、p85)及p-Akt2表達，并利用胰島灌流評估胰高血糖素及胰島素動態(tài)分泌。
　　結果：
　　1、與Ad-siControl組相比，Ad-siAT1R組AT1R mRNA和蛋白表達水平顯著下降;
　　2、Ad-siAT1R組IRS-1、IRS-2、PI3K(p85)及p-Akt2蛋白表達水平Ad-siControl組均顯著上調;
　　3、胰島灌流顯示Ad-siAT1R組在高糖刺激1-2min后，胰島素分泌急劇上升達

10、到高峰140 mU/L，為基礎水平的2.8倍，而其胰高血糖素分泌立即出現(xiàn)顯著性下降，達14pmol/L，與基礎值相比，下降13pmol/L;而Ad-siControl組在高糖刺激1-2min時胰島素分泌也出現(xiàn)一定程度的升高，峰值僅為90 mU/L，為基礎值的1.8倍，其胰高血糖素分泌逐漸下降至35pmol/L，僅比基礎值下降5pmol/L。
　　結論：
　　RNAi技術特異性抑制胰島局部RAS顯著改善了db/db小鼠胰高血糖