RNA干擾特異性阻斷胰島局部RAS對(duì)胰高血糖素分泌功能的影響及其機(jī)制.pdf

1、本研究利用db/db小鼠為研究對(duì)象，觀察其胰島局部AT1R的表達(dá)，通過腺病毒介導(dǎo)RNA干擾（RNAinterference，RNAi）特異性抑制胰島局部AT1R的表達(dá)，觀察其對(duì)胰島素相關(guān)信號(hào)通路分子表達(dá)的影響，并利用胰島灌流評(píng)估其胰高血糖素及胰島素動(dòng)態(tài)分泌功能，探討其可能的作用機(jī)制，進(jìn)而揭示胰島局部RAS在內(nèi)分泌胰腺中的作用及與2型糖尿病的關(guān)系，為尋找糖尿病防治藥物的新作用靶點(diǎn)拓展新思路。具體研究分為以下三個(gè)部分:
　　第一章 d

2、b/db糖尿病小鼠胰島局部血管緊張素Ⅱ1型受體的表達(dá)
　　目的：
　　觀察db/db小鼠胰島局部AT1R的表達(dá)，以進(jìn)一步揭示胰島局部RAS在胰高血糖素分泌功能中的作用。
　　方法：
　　選取15只8周齡無特定病原體(SPF)級(jí)雌性C57BL/KsJ-db/db小鼠及15只同周齡同窩出生的C57BL/KsJ-db/m小鼠。分離培養(yǎng)db/db和db/m小鼠胰島，熒光實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)及Westem bl

3、ot檢測(cè)AT1R mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　db/db小鼠胰島AT1R mRNA及蛋白的表達(dá)水平均為db/m小鼠胰島的3倍左右，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[mRNA:（320-25）％vs(100±8)％，P＜0.05;蛋白:（310±20）％vs(100±8)％)，P＜0.05]。
　　結(jié)論：
　　db/db糖尿病小鼠胰島局部AT1R過度表達(dá)。
　　第二章 db/db糖尿病小鼠胰島局部AT1R基因R

4、NA干擾重組腺病毒的構(gòu)建
　　目的：
　　構(gòu)建AT1R基因靶向RNAi重組腺病毒，并在293包裝細(xì)胞中擴(kuò)增制備重組病毒。
　　方法：
　　由生物公司合成針對(duì)db/db小鼠AT1R mRNA的特異性小分子干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）真核表達(dá)質(zhì)粒psiRNA-AT1R;雙酶切得到 siRNA-AT1R表達(dá)片段;插入pAdTrack載體上，獲得轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pAdTrack-siRNA

5、-AT1R;后者經(jīng)線性化處理后，轉(zhuǎn)化含有腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的大腸桿菌BJ5183進(jìn)行同源重組;PacⅠ酶切鑒定，篩選出正確重組腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-siRNA-AT1R;酶切線性化后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞包裝成重組病毒Ad-siAT1R，熒光顯微鏡觀察綠色熒光表達(dá)，行PCR鑒定。通過反復(fù)感染擴(kuò)增病毒，以氯化銫密度梯度離心法純化重組腺病毒。同法擴(kuò)增空載病毒Ad-siControl至相當(dāng)量，并純化。
　　結(jié)果：
　　P

6、acⅠ酶切鑒定證實(shí)重組腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-siRNA-AT1R構(gòu)建成功:于熒光顯微鏡下觀察到pAdEasy-siRNA-AT1R轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后有綠色熒光蛋白表達(dá);PCR鑒定說明重組腺病毒中含siRNA-AT1R片斷，成功構(gòu)建了攜帶含AT1R干擾RNA的重組腺病毒Ad-siAT1R，在293包裝細(xì)胞中擴(kuò)增后，利用氯化銫梯度離心純化法獲得約3.6×109efu/ml滴度的重組腺病毒。
　　結(jié)論：
　　利用AdEasy-1

7、系統(tǒng)可快速高效制備表達(dá)AT1R干擾RNA的重組腺病毒，為進(jìn)一步研究胰島局部RAS在胰高血糖素分泌功能中的作用奠定了基礎(chǔ)。
　　第三章 胰島灌流評(píng)估db/db小鼠胰島局部AT1R基因沉默后的胰高血糖素動(dòng)態(tài)分泌功能
　　目的：
　　觀察AT1R基因靶向RNAi重組腺病毒對(duì)db/db小鼠胰島中AT1R表達(dá)以及IRS、PI3K調(diào)節(jié)亞基p85[PI3K(p85)]以及磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（p-Akt2）的表達(dá)，并利用離體

8、胰島灌流系統(tǒng)評(píng)估胰島素及胰高血糖素動(dòng)態(tài)分泌情況，探討其可能的機(jī)制。
　　方法：
　　db/db小鼠胰島過夜培養(yǎng)，分為3組處理:Ad-siAT1R組，按MOI100，加入Ad-siAT1R病毒液，作用2小時(shí)，更換新培養(yǎng)液;空病毒組:以不表達(dá)任何目的基因的腺病毒Ad-siControl用相同的MOI感染;空白對(duì)照組:同等條件下培養(yǎng)但未行任何干預(yù)處理的胰島。胰島繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，此后檢測(cè)AT1R、IRS-1、IRS-2、P13K(

9、p85)及p-Akt2表達(dá)，并利用胰島灌流評(píng)估胰高血糖素及胰島素動(dòng)態(tài)分泌。
　　結(jié)果：
　　1、與Ad-siControl組相比，Ad-siAT1R組AT1R mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著下降;
　　2、Ad-siAT1R組IRS-1、IRS-2、PI3K(p85)及p-Akt2蛋白表達(dá)水平Ad-siControl組均顯著上調(diào);
　　3、胰島灌流顯示Ad-siAT1R組在高糖刺激1-2min后，胰島素分泌急劇上升達(dá)

10、到高峰140 mU/L，為基礎(chǔ)水平的2.8倍，而其胰高血糖素分泌立即出現(xiàn)顯著性下降，達(dá)14pmol/L，與基礎(chǔ)值相比，下降13pmol/L;而Ad-siControl組在高糖刺激1-2min時(shí)胰島素分泌也出現(xiàn)一定程度的升高，峰值僅為90 mU/L，為基礎(chǔ)值的1.8倍，其胰高血糖素分泌逐漸下降至35pmol/L，僅比基礎(chǔ)值下降5pmol/L。
　　結(jié)論：
　　RNAi技術(shù)特異性抑制胰島局部RAS顯著改善了db/db小鼠胰高血糖