人胰島素基因乳腺特異性表達載體的構(gòu)建.pdf

1、為了構(gòu)建一個高效的人胰島素基因乳腺特異性表達載體，從而為利用動物乳腺生產(chǎn)人胰島素打下基礎(chǔ)，我們利用LongPCR技術(shù)克隆了長為6.7kb的山羊β酪蛋白基因5'調(diào)控區(qū)，并且在克隆出人胰島素基因的基礎(chǔ)上，以奶牛β酪蛋白調(diào)控區(qū)為指導(dǎo)元件，以綠色熒光蛋白基因(EGFP)為報告基因，構(gòu)了人胰島素基因的乳腺特異性表達載體pBI-GFP，為利用動物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)人胰島素的研究打下了堅實的基礎(chǔ)。相關(guān)研究結(jié)果如下： 1.通過LongPCR技術(shù)

2、成功從人基因組中擴增出長度為1.6kb人胰島素基因，其中包含有完整的編碼序列。序列分析表明，片段與GenBank中登陸的人胰島素基因DNA序列的同源性為99％，有三處發(fā)生了鹼基突變，這并沒有改變蛋白的功能 2.根據(jù)表達載體pEGFP-C1上的多克隆位點以及質(zhì)粒pBL重的CSN2啟動子序列重新設(shè)計引物，在INS的兩端添加NheI和BamHⅠ酶切位點，采用定向克隆的方法，成功的將INS基因與CSN2調(diào)控序列融合在一起。 3.

3、采用定向克隆的方法，利用真核表達載體pEGFP-C1構(gòu)建了含有報告基因的人胰島素乳腺表達載體pBI-GFP。 4.采用LongPCR法，分兩段克隆了山羊CSN2基因長為6.7kb的5'調(diào)控區(qū)。構(gòu)建了乳腺表達載體pGGC6.7-GFP。 5.脂質(zhì)體法將pGGC6.7-GFP轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的乳腺上皮細胞，經(jīng)G418初步篩選，通過熒光顯微鏡觀察到報告基因綠色熒光蛋白的表達。結(jié)果顯示，本實驗所克隆的山羊CSN25'調(diào)控區(qū)具有啟動子