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文檔簡介
1、近幾十年來,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)RNA非編碼基因片段具有應(yīng)用在診斷和治療重大疾病方面潛在的商業(yè)價值。非編碼基因片段包括非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)和編碼蛋白mRNA的非編碼區(qū)段(untranslated region,UTR)。非編碼RNA是所有不編碼蛋白質(zhì)的RNA轉(zhuǎn)錄本的統(tǒng)稱,其代表是微小RNA(microRNA,miRNA)和長非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)。在可編碼蛋
2、白mRNA上存在的非編碼區(qū)段代表是核糖開關(guān)(riboswitch)。
微小RNA是一類長度介于18-25個核苷酸的非編碼RNA,研究表明人類編碼蛋白的基因中約30%受到miRNAs調(diào)控。它們參與基因的表達及調(diào)控、RNA加工及剪切和蛋白質(zhì)翻譯等生物學過程,強烈調(diào)控著生物的生長和發(fā)育。長非編碼RNA是一類長度大于二百個核苷酸的非編碼RNA,它們參與基因的表達及調(diào)控、RNA加工及編輯、蛋白質(zhì)翻譯、印跡調(diào)控和端粒系統(tǒng)的調(diào)控等,同時其自
3、身還可形成核酶或核糖開關(guān)。
核糖開關(guān)是一類能夠通過與代謝物小分子結(jié)合引起構(gòu)象變化而調(diào)控下游基因表達的mRNA分子。核糖開關(guān)在細菌中有著廣泛的分布,同時調(diào)控細菌體內(nèi)很多重要基因的表達過程,調(diào)控細菌的基本生命代謝和信號傳導。
通常對于生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的研究都是運用結(jié)構(gòu)生物學的方法達成。以RNA為例,其主要研究步驟包括:目的RNA獲得與純化、RNA結(jié)晶、衍射和相角數(shù)據(jù)的收集及處理修正,最后是結(jié)構(gòu)的描述和功能關(guān)系的研究。
4、從上述步驟可以看出,如何獲得轉(zhuǎn)錄量大、純度高的目的RNA是所有結(jié)構(gòu)與功能研究的基礎(chǔ)。
目前,有關(guān)運用RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄生成RNA時有報道。但是,有關(guān)用于非編碼類RNA結(jié)晶的體外轉(zhuǎn)錄卻鮮有報道,特別是對晶體結(jié)構(gòu)模板體外轉(zhuǎn)錄的優(yōu)化實驗更是未見報道。
本文的立意點和創(chuàng)新點即在于選擇SAM-V核糖開關(guān)晶體結(jié)構(gòu)模板作為代表物,參考Doudna等報道的體外轉(zhuǎn)錄體系,對相關(guān)的反應(yīng)條件進行優(yōu)化,得到一個較優(yōu)的用于非編碼類RNA結(jié)晶
5、的體外轉(zhuǎn)錄體系,從而提高目的RNA體外轉(zhuǎn)錄的效率。
選擇的優(yōu)化條件包括反應(yīng)時間、NTPs添加濃度和鎂離子添加濃度等幾個方面。每次只改變一個因素,初步設(shè)計實驗條件,對所得實驗結(jié)果用聚丙烯酰胺凝膠檢測,并使用Bio-rad儀器對凝膠進行拍照和分析,在相同背景下對所得條帶的RNA濃度進行估算,得到目的RNA相對百分含量,繪得其變化趨勢圖。
其中有關(guān)反應(yīng)時間的結(jié)果表明,目的RNA相對百分含量隨著反應(yīng)時間的延長不斷提高,在8h
6、時達到最高值,對比標準對照體系目的RNA產(chǎn)率提高了50%;NTPs添加濃度的結(jié)果表明,目的RNA相對百分含量隨著NTPs添加濃度的提高而不斷提高,在添加濃度為4 mM/L時達到最高值,對比標準對照體系目的RNA產(chǎn)率提高了50%;鎂離子濃度的結(jié)果表明,目的RNA相對百分含量隨著Mg2+添加濃度的提高而不斷提高,在Mg2+添加濃度為85mM/L時達到最高值,對比標準對照體系目的RNA產(chǎn)率提高了將近80%。最后,將上述單項最優(yōu)條件組合成為RN
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