27615.嗜熱厭氧乙醇桿菌體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的構(gòu)建及應(yīng)用

1、學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：1、堅(jiān)持以“求實(shí)、創(chuàng)新一的科學(xué)精神從事研究工作。2、本論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作和取得的研究成果。3、本論文中除引文外，所有實(shí)驗(yàn)、數(shù)據(jù)和有關(guān)材料均是真實(shí)的。4、本論文中除引文和致謝的內(nèi)容外，不包含其他人或其它機(jī)構(gòu)已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。5、其他同志對本研究所做的貢獻(xiàn)均已在論文中作了聲明并表示了謝意。研究生簽名：數(shù)Et期：叢絲：』：么幺學(xué)位論文使用授權(quán)聲明本人完全了解南京師范大學(xué)有關(guān)保留、使

2、用學(xué)位論文的規(guī)定，學(xué)校有權(quán)保留學(xué)位論文并向國家主管部門或其指定機(jī)構(gòu)送交論文的電子版和紙質(zhì)版；有權(quán)將學(xué)位論文用于非贏利目的的少量復(fù)制并允許論文進(jìn)入學(xué)校圖書館被查閱；有權(quán)將學(xué)位論文的內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索；有權(quán)將學(xué)位論文的標(biāo)題和摘要匯編出版。保密的學(xué)位論文在解密后適用本規(guī)定。研究生簽名：望磊左，日期：塑絲：』：[正摘要摘要嗜熱厭氧乙醇桿菌(Thermoanaerobacterethanolicus)作為嗜熱菌中乙醇產(chǎn)量較高的菌種，它具有

3、高生長溫度，較好的耐酸性以及完整的纖維素和半纖維素代謝系統(tǒng)，這些優(yōu)點(diǎn)使其成為乙醇生產(chǎn)茵改造的熱點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)因背景干擾低，反應(yīng)組分明確，結(jié)果清晰準(zhǔn)確成為研究菌體轉(zhuǎn)錄情況的有力工具。本研究構(gòu)建Zethanolicus的體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，并運(yùn)用該系統(tǒng)對ZethanolicusJW200中的未知蛋白Tethll的功能進(jìn)行研究。。體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的構(gòu)建關(guān)鍵是獲得RNA聚合酶。這方面的研究主要是通過異源菌表達(dá)體外重組RNA聚合酶以及提取天然菌的RNA聚合酶

4、兩個方面來進(jìn)行的。體外重組中，首先分別構(gòu)建含有伐、p、p’、∞和。亞基的表達(dá)載體pETalphaHis、pETbetaHis、pETbetaHis、pETomega以及pETsigmaHis，在大腸桿菌中異源表達(dá)并純化獲取純的亞基。其中將僅、p、p’和∞按照22：1：1：1的比例進(jìn)行體外重組RNA聚合酶核心酶，并通過Histag親和層析技術(shù)獲得了純化的核心酶。天然酶的純化是利用聚乙醇胺粗沉淀與NaCl抽提、硫銨沉淀、肝素親和層析以：及D

5、EAE陰離子交換層析技術(shù)經(jīng)過4步純化獲得了純度為95％天然RNA聚合酶核心酶。另外我們根據(jù)ZethanolicusJW200中的adhB基因及其側(cè)翼序列并以pHsh質(zhì)粒為模體，構(gòu)建了轉(zhuǎn)錄所用的模板質(zhì)粒pHshtmpl。在69。C下，以該質(zhì)粒為模板分別用重組RNA聚合和天然RNA聚合酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，使用地高辛染色檢測轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，重組RNA聚合酶沒有檢測到酶活而天然RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄出預(yù)計(jì)大小的條帶。TethlI作為一個背景完全未知的蛋白，我們采取

6、生物信息學(xué)預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)，電泳遷移率變動分析和體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)對其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究。首先根據(jù)該蛋白N段氨基酸序列的測序結(jié)果，我們將該蛋白的基因克隆到pET28a()中。測序結(jié)果表明該蛋白有297bp，編碼98個氨基酸，理論分子量為11kD。NCBI比對結(jié)果顯示該蛋白一級結(jié)構(gòu)上具有兩個保守區(qū)域，一個在811個氨基酸之間，j另一個位于第43個氨基酸和第83個氨基酸之間，在三級結(jié)構(gòu)上該蛋白具有螺旋轉(zhuǎn)角螺旋的DNA結(jié)合模體。通過電泳遷移率變動實(shí)驗(yàn)驗(yàn)