侵染蘿卜的dsRNA病毒研究——帶病毒蘿卜的組織培養(yǎng)、細(xì)胞和分子生物學(xué)研究.pdf

1、蘿卜(Raphanus sativus)是一種十字花科蔬菜,具有重要的食用和藥用價(jià)值。上世紀(jì)七八十年代,Natsuaki等在日本的一種蘿卜品種首先發(fā)現(xiàn)了雙鏈RNA(dsRNA)病毒,命名為蘿卜黃邊病毒(radishyellow edge virus,RYED),該病毒后來(lái)被分類(lèi)到Partitiviridea的Alphacryptovirus。本實(shí)驗(yàn)室觀察到杭州市栽培的一點(diǎn)紅蘿卜品種普遍具有黃邊癥狀并對(duì)此進(jìn)行了系統(tǒng)研究,我們先后在一點(diǎn)紅蘿

2、卜中分離得到屬于雙分病毒科(Partitiviridea)的三種dsRNA病毒,分別命名為Raphanus sativus virus1(RasV1)、Raphanus sativus virus2(RasV2)和Raphanus sativus virus3(RasV3),并對(duì)其基因組結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了分析。
　　 本研究從不同地區(qū)收集不同品種的蘿卜種子在溫室栽培,部分植株表現(xiàn)出輕微的癥狀,如黃邊、輕微花葉或斑駁,輕微皺縮、葉片翻

3、卷等。dsRNA抽提分析結(jié)果顯示,所有品種的蘿卜葉組織中均提取到dsRNA條帶。因此,繼續(xù)對(duì)上述三種潛隱性dsRNA病毒進(jìn)行了細(xì)胞和分子生物學(xué)研究。取得如下結(jié)果:
　　 (1)鑒于雙分病毒科病毒不能通過(guò)嫁接或摩擦接種,無(wú)已知的自然傳播介體,種子和花粉傳播可能是唯一已知的傳播方式,本研究首先建立了蘿卜的組培體系,以期獲得擬研究蘿卜材料的無(wú)性繁殖系。對(duì)外植體選擇進(jìn)行優(yōu)化,選取無(wú)菌幼苗的頂芽誘導(dǎo)叢生芽,擴(kuò)繁后誘導(dǎo)生根,經(jīng)過(guò)煉苗移栽獲得

4、完整成活植株。蘿卜組培過(guò)程中發(fā)現(xiàn),以MS+0.01mg/L NAA+6.0mg/L6-BA+3.0mg/L AgNO3為叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基效果最好,誘導(dǎo)率達(dá)100％;采用MS培養(yǎng)基或者1/2MS+1.0mg/LNAA作為誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基,成功率40％以上;穴盤(pán)煉苗對(duì)獲得成株蘿卜起關(guān)鍵作用,采用全溫室土或者1/3珍珠巖+2/3溫室土的煉苗基質(zhì),成活率最高,達(dá)60％以上。
　　 (2)對(duì)一點(diǎn)紅蘿卜組培苗進(jìn)行dsRNA抽提分析和斑點(diǎn)雜交,

5、建立了一點(diǎn)紅蘿卜中dsRNA病毒檢測(cè)體系,并篩選出只帶有RasV1、帶有RasV1和RasV2以及只帶有RasV3的無(wú)性繁殖系,對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)繁,誘導(dǎo)生根進(jìn)行移栽,獲得大量同質(zhì)的組培再生植株。
　　 (3)對(duì)帶有RasV1、帶有RasV1和RasV2以及只帶有RasV3的一點(diǎn)紅蘿卜組培植株進(jìn)行組織超薄切片電鏡觀察,結(jié)果顯示:寄主細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常,葉綠體片層結(jié)構(gòu)排列整齊,沒(méi)有異常的空泡化現(xiàn)象。但是,被RasV1侵染的蘿卜葉綠體膨脹變圓,不

6、同于常規(guī)的梭形,且在葉綠體中發(fā)現(xiàn)晶格狀物質(zhì);在RasV3侵染的蘿卜葉綠體中同樣發(fā)現(xiàn)這種晶格狀物質(zhì),推測(cè)可能是病毒基質(zhì),或者病毒誘導(dǎo)的某種植物蛋白過(guò)表達(dá)產(chǎn)物。利用組培擴(kuò)繁的蘿卜植株進(jìn)行光合生理的比較研究,葉綠素含量、光合氣體交換參數(shù)和葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定結(jié)果表明,三類(lèi)植株的葉綠素含量差別不顯著;被RasV1侵染的植株凈光合速率值(Pn)在各時(shí)期均高于帶有RasV1和RasV2以及只帶有RasV3的植株,而胞間CO2濃度值(Ci)相

7、反,氣孔導(dǎo)度值(Gs)和蒸騰速率值(E)變化不顯著,推測(cè)這一現(xiàn)象是非氣孔限制因素在起作用;PSⅡ潛在量子效率指標(biāo)(Fv/Fm),PSⅡ有效光化學(xué)量子產(chǎn)量(Fv'/Fm'),PSⅡ?qū)嶋H量子產(chǎn)量(ΦPSⅡ)、光化學(xué)淬滅系數(shù)(qp)和非光化學(xué)淬滅系數(shù)(NPQ)差別不顯著,推測(cè)不同的dsRNA病毒對(duì)寄主光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)反應(yīng)中心不產(chǎn)生明顯破壞作用,或者破壞程度一致。在葉綠體中觀察到的晶格狀物質(zhì)對(duì)寄主光合作用有無(wú)影響還有待進(jìn)一步研究。
　　

8、 (4)利用已知植物miRNA芯片的雜交檢測(cè)蘿卜miRNA的結(jié)果表明:以1450條植物miRNA為探針檢測(cè)到545條成熟miRNA(含miRNA*)。依據(jù)SangermiRbase15.0版本登陸的miRNA序列進(jìn)行同源性分析,所檢測(cè)到的miRNA分布在31個(gè)植物物種中,其中198條為數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道的十字花科miRNA(含miRNA*),分布在擬南芥(Arabidopsis thaliana)、油菜(Brassica napus)和蕪