侵染蘿卜的dsRNA病毒研究——帶病毒蘿卜的組織培養(yǎng)、細胞和分子生物學研究.pdf

1、蘿卜(Raphanus sativus)是一種十字花科蔬菜,具有重要的食用和藥用價值。上世紀七八十年代,Natsuaki等在日本的一種蘿卜品種首先發(fā)現了雙鏈RNA(dsRNA)病毒,命名為蘿卜黃邊病毒(radishyellow edge virus,RYED),該病毒后來被分類到Partitiviridea的Alphacryptovirus。本實驗室觀察到杭州市栽培的一點紅蘿卜品種普遍具有黃邊癥狀并對此進行了系統(tǒng)研究,我們先后在一點紅蘿

2、卜中分離得到屬于雙分病毒科(Partitiviridea)的三種dsRNA病毒,分別命名為Raphanus sativus virus1(RasV1)、Raphanus sativus virus2(RasV2)和Raphanus sativus virus3(RasV3),并對其基因組結構特征進行了分析。
　　 本研究從不同地區(qū)收集不同品種的蘿卜種子在溫室栽培,部分植株表現出輕微的癥狀,如黃邊、輕微花葉或斑駁,輕微皺縮、葉片翻

3、卷等。dsRNA抽提分析結果顯示,所有品種的蘿卜葉組織中均提取到dsRNA條帶。因此,繼續(xù)對上述三種潛隱性dsRNA病毒進行了細胞和分子生物學研究。取得如下結果:
　　 (1)鑒于雙分病毒科病毒不能通過嫁接或摩擦接種,無已知的自然傳播介體,種子和花粉傳播可能是唯一已知的傳播方式,本研究首先建立了蘿卜的組培體系,以期獲得擬研究蘿卜材料的無性繁殖系。對外植體選擇進行優(yōu)化,選取無菌幼苗的頂芽誘導叢生芽,擴繁后誘導生根,經過煉苗移栽獲得

4、完整成活植株。蘿卜組培過程中發(fā)現,以MS+0.01mg/L NAA+6.0mg/L6-BA+3.0mg/L AgNO3為叢生芽誘導培養(yǎng)基效果最好,誘導率達100％;采用MS培養(yǎng)基或者1/2MS+1.0mg/LNAA作為誘導生根培養(yǎng)基,成功率40％以上;穴盤煉苗對獲得成株蘿卜起關鍵作用,采用全溫室土或者1/3珍珠巖+2/3溫室土的煉苗基質,成活率最高,達60％以上。
　　 (2)對一點紅蘿卜組培苗進行dsRNA抽提分析和斑點雜交,

5、建立了一點紅蘿卜中dsRNA病毒檢測體系,并篩選出只帶有RasV1、帶有RasV1和RasV2以及只帶有RasV3的無性繁殖系,對其進行擴繁,誘導生根進行移栽,獲得大量同質的組培再生植株。
　　 (3)對帶有RasV1、帶有RasV1和RasV2以及只帶有RasV3的一點紅蘿卜組培植株進行組織超薄切片電鏡觀察,結果顯示:寄主細胞結構正常,葉綠體片層結構排列整齊,沒有異常的空泡化現象。但是,被RasV1侵染的蘿卜葉綠體膨脹變圓,不

6、同于常規(guī)的梭形,且在葉綠體中發(fā)現晶格狀物質;在RasV3侵染的蘿卜葉綠體中同樣發(fā)現這種晶格狀物質,推測可能是病毒基質,或者病毒誘導的某種植物蛋白過表達產物。利用組培擴繁的蘿卜植株進行光合生理的比較研究,葉綠素含量、光合氣體交換參數和葉綠素熒光誘導動力學參數測定結果表明,三類植株的葉綠素含量差別不顯著;被RasV1侵染的植株凈光合速率值(Pn)在各時期均高于帶有RasV1和RasV2以及只帶有RasV3的植株,而胞間CO2濃度值(Ci)相

7、反,氣孔導度值(Gs)和蒸騰速率值(E)變化不顯著,推測這一現象是非氣孔限制因素在起作用;PSⅡ潛在量子效率指標(Fv/Fm),PSⅡ有效光化學量子產量(Fv'/Fm'),PSⅡ實際量子產量(ΦPSⅡ)、光化學淬滅系數(qp)和非光化學淬滅系數(NPQ)差別不顯著,推測不同的dsRNA病毒對寄主光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)反應中心不產生明顯破壞作用,或者破壞程度一致。在葉綠體中觀察到的晶格狀物質對寄主光合作用有無影響還有待進一步研究。
　　

8、 (4)利用已知植物miRNA芯片的雜交檢測蘿卜miRNA的結果表明:以1450條植物miRNA為探針檢測到545條成熟miRNA(含miRNA*)。依據SangermiRbase15.0版本登陸的miRNA序列進行同源性分析,所檢測到的miRNA分布在31個植物物種中,其中198條為數據庫中已報道的十字花科miRNA(含miRNA*),分布在擬南芥(Arabidopsis thaliana)、油菜(Brassica napus)和蕪