山核桃嫁接成活相關(guān)基因克隆.pdf

1、嫁接是一門園藝技術(shù),其成活過程包含細(xì)胞脫分化、再分化等重大理論問題。山核桃嫁接是公認(rèn)的難題,為了深入探索這一珍貴物種的嫁接分子機(jī)理和調(diào)控機(jī)制,本研究采用cDNA-AFLP技術(shù)和定量RT-PCR技術(shù)對(duì)山核桃嫁接成活相關(guān)基因進(jìn)行篩選、分離和生物信息學(xué)分析,結(jié)果表明:
　　 1.利用改良的CTAB法提取的嫁接樣品總RNA質(zhì)量高、完整性好、無(wú)雜質(zhì),適用于cDNA-AFLP分析和熒光定量RT-PCR分析。
　　 2.利用SMART

2、TM PCR cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄獲得的8個(gè)實(shí)驗(yàn)材料雙鏈cDNA,完整性好,滿足實(shí)驗(yàn)要求。
　　 3.用識(shí)別4堿基和6堿基的限制性內(nèi)切酶TaqⅠ、AseⅠ消化cDNA,所得片段長(zhǎng)度符合技術(shù)要求。酶切片段與人工接頭連接后進(jìn)行預(yù)擴(kuò),獲得相當(dāng)濃度的200～1000bp的酶切片段拷貝。
　　 4.選用100對(duì)選擴(kuò)引物進(jìn)行了選擇性擴(kuò)增。改進(jìn)選擴(kuò)程序,采用高溫(65℃)退火結(jié)合循環(huán)降溫方法,獲得高濃度的特異性產(chǎn)

3、物。
　　 5.用6％聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合銀染對(duì)選擴(kuò)產(chǎn)物進(jìn)行差異顯示,結(jié)果共獲得300多條差異表達(dá)片段。經(jīng)切膠回收、純化和二次克隆等所得差異片段100多條。共測(cè)回來(lái)的序列66條,經(jīng)Blast比序,除去重復(fù)序列17條,結(jié)果獲得了49條TDFs。
　　 6.選取其中12條基因進(jìn)行定量RT-PCR驗(yàn)證分析,結(jié)果顯示,其中八個(gè)克隆translational initiation factor eIF-4A,3'-5'-exor

4、ibonuclease/RNA binding(AT2G47220),18號(hào)未知基因,isolate K1/E32 K1 glycoprotein,putative auxin response factor1,waterchannel(PIP1B),Glycine max catalase(cat4),65號(hào)未知基因與cDNA-AFLP的表達(dá)一致,一個(gè)克隆25號(hào)未知基因與cDNA-AFLP的表達(dá)基本一致,而其余三個(gè)克隆17號(hào)未知基因,

5、beta family G-protein,cdc20 protein(CDC20.2)的表達(dá)與cDNA-AFLP的表達(dá)結(jié)果有差異。本實(shí)驗(yàn)cDNA-AFLP的表達(dá)譜中的75％得到驗(yàn)證。
　　 7.在49條TDFs中,有20個(gè)編碼已知功能蛋白,8個(gè)編碼未知功能蛋白,其余的21個(gè)與未注釋的基因組序列相似,或者在核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)無(wú)同源序列。對(duì)20個(gè)已知功能的基因進(jìn)行功能分析,它們分屬于物質(zhì)運(yùn)輸,代謝和能量,細(xì)胞周期,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等9類,說明山