山核桃嫁接過程中Aux-IAA基因功能研究和小RNA測序分析.pdf

1、作為山區(qū)農(nóng)民脫貧致富的主要經(jīng)濟樹種，山核桃（Carya cathayensis Sarg.）具有很多困難的問題比如童期較長，不容易采收，樹體高大以及園藝化栽培等，這就是山核桃的產(chǎn)業(yè)發(fā)展上的巨大難題。但是植物嫁接手段是植物的無性繁殖里面比較重要的植物栽培技術(shù)，也是解決山核桃優(yōu)良種質(zhì)及園藝栽培的重要手段。并且隨著嫁接的成熟，人們開始探討嫁接的機理問題，從而能夠更好地指導(dǎo)嫁接。本研究根據(jù)基因克隆獲得山核桃生長素原初響應(yīng)基因（CcIAA）片段，

2、采用RACE技術(shù)克隆CcIAA基因的cDNA全長，同時進行同源性比對和系統(tǒng)進化樹分析，并利用qRT-PCR，Western blot技術(shù)分析了在山核桃嫁接過程中 CcIAA基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上的表達情況。同時為了探究小RNA在山核桃的嫁接過程里面所起到的功能作用，研究了山核桃嫁的接過程里三個不同階段（0天，7天和14天）的小RNA測序數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析。主要的研究結(jié)果：
　　1、克隆獲得的CcIAA cDNA從起始的密碼子atg

3、，到終止的密碼子tga一共含有591個堿基，共編碼196個氨基酸。CcIAA與17種樹種的17個基因進行同源性比對，發(fā)現(xiàn)該基因與其他植物Aux/IAA基因同源性比較高。系統(tǒng)進化樹分析同樣表明CcIAA與蓖麻RcIAA基因聚為一類，說明它們的親緣關(guān)系最相近，而與其關(guān)系比較遠的則是鷹嘴豆CaIAA和菜豆PvIAA。
　　2、利用 qRT-PCR技術(shù)，對不同激素處理條件下（如空白的對照，4mg/l IAA和0.3ug/l NPA）不同嫁

4、接時間段（0d,1d,3d,5d,7d和14d）山核桃CcIAA基因的轉(zhuǎn)錄表達進行分析。結(jié)果說明：對照組里面，山核桃 CcIAA基因表達量在砧木和接穗中都是從嫁接前到嫁接后7天都是持續(xù)下降的，并且在7天時其表達量幾乎為0，但是到14天其表達量會比嫁接前更高。通過IAA處理的山核桃CcIAA基因表達量在嫁接后1天會急劇升高，在隨后的4天里，該基因的表達量逐漸下降，然后一直到14天，其表達量都是上升的。砧木和接穗中該基因的表達趨勢一致。通過

5、NPA處理，無論是接穗還是砧木，山核桃 CcIAA基因表達量明顯在嫁接之后7天里都是比較低的，到14天明顯升高。用IAA處理過的山核桃CcIAA基因表達量和對照相比是升高的，而用NPA處理過的山核桃CcIAA基因表達量和對照相比也是升高的，但是用IAA處理的表達量表達量則升嫁接前期卻沒有NPA處理后上升明顯。
　　3、利用Western blot技術(shù)，對不同激素處理條件下（如空白作對照，4mg/l IAA和0.3ug/l NPA）

6、在不同的嫁接時間段（0d,1d,3d,5d,7d和14d）山核桃CcIAA蛋白表達量進行分析。結(jié)果表明：CcIAA蛋白在山核桃嫁接的過程中表達量大都是不太相似的。對照中，不管是砧木還是接穗中，CcIAA的蛋白表達量在整個嫁接過程中都是比較低的，并且到14天時表達量明顯增加；而用IAA處理后，山核桃CcIAA蛋白表達量明顯升高，特別是接穗中的表達量更高；但是用IAA抑制劑NPA處理之后，和對照相比，CcIAA蛋白表達量略有增加，但是和IA

7、A處理對比，發(fā)現(xiàn)該蛋白在前期明顯受到抑制。
　　4、通過對山核桃中三個sRNA文庫的測序數(shù)據(jù)進行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明21個保守miRNA屬于13個miRNA基因家族，但是10個新miRNA和8個潛在的新miRNA屬于15個miRNA基因家族。在這些miRNAs中，選取14個miRNAs包含7個保守miRNAs和7個新miRNAs進行表達分析，在山核桃嫁接后7和14天（0天為對照），除了其中三個小RNA cca-miRS4，cc

8、a-miRS5和cca-miRS6與Solexa測序表達結(jié)果不一致，其余11個miRNAs都顯示出與Solexa測序結(jié)果具有相同的表達趨勢。本實驗小RNA測序表達譜中的79％得到驗證。另外本研究還預(yù)測了保守miRNA基因的89個靶基因和新的 miRNA基因的26個靶基因。選取四個 miRNA靶基因（cca-miR156，cca-miR159，cca-miR390和cca-miR827）進行qRT-PCR分析，結(jié)果表明miRNAs與其相關(guān)