豬圓環(huán)病毒2型和豬細小病毒體外混合感染致病機制的研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type2，PCV2)是引起豬圓環(huán)病毒相關疾病(porcinecircovirus associated disease，PCVAD)的主要病原，是重要的免疫抑制性疾病，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失。豬圓環(huán)病毒2型單獨感染并不能引起典型的臨床癥狀，當與其它病原體混合感染時能促進疾病的發(fā)生。豬圓環(huán)病毒2型與豬細小病毒有共同的靶細胞，其混合感染的發(fā)病機制仍不清楚，鑒于豬圓環(huán)病毒2型與

2、豬細小病毒混合感染是模擬斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS)的典型發(fā)病模型。本研究擬通過檢測豬圓環(huán)病毒2型與豬細小病毒缽外混合感染不同細胞細胞因子水平變化，對其混合感染的機制進行初步探討。
　　1.PCV2，PPV, IFN-γ，TNF-α，IL-10，β-actin real-time PCR檢測方法的建立
　　本研究根據(jù)GenBank中

3、PCV2，PPV,豬IFN-γ，豬TNF-α，豬IL-10，β-actin基因序列設計引物，用RT-PCR擴增豬肺泡巨噬細胞中相應的目的基因片段，連接到pMD18-T載體中，經(jīng)測序驗證基因序列的正確性。再根據(jù)GenBank中相應序列設計PCV2，PPV,豬IFN-γ，豬豬TNF-Ⅱ，豬IL-10，豬β-actin real-time PCR擴增引物，以上述構建的重組質(zhì)粒為模板，優(yōu)化real-time PCR反應體系及引物濃度，建立檢測P

4、CV2，PPV,豬IFN-γ,豬TNF-α，豬IL-10，豬β-actin基因的定量方法，并進行了方法學評價。結(jié)果顯示，以優(yōu)化條件后real-time PCR反應所建立的標準曲線各參數(shù)均符合要求，標準曲線的判定系數(shù)R2均大于0.98，模板濃度在103-108 copies/μL具有良好的擴增反應，重復性、穩(wěn)定性和特異性良好。
　　2.PCV2與PPV混合感染對原代PAM的影響
　　本研究通過PCV2和PPV混合感染PAM后，

5、檢測感染后不同時間PCV2和PPV病毒核酸拷貝數(shù)及IFN-γ，TNF-α，IL-10 mRNA表達的動態(tài)變化，分析PCV2和PPV混合感染對細胞免疫反應的影響。將PAM分為4組:PPV單獨感染組、PCV2單獨感染組、PCV2與PPV混合感染組、對照組。在接種病毒12h、24h、36h、48h、60h、72h各時間點提取病毒DNA及PAM細胞總RNA。用已經(jīng)建立的real-time PCR法檢測各組中病毒核酸拷貝數(shù)及IFN-γ，TNF-α

6、，IL-10 mRNA表達的動態(tài)變化。結(jié)果顯示，PCV2和PPV混合感染后，PCV2與PPV混合感染組PCV2病毒核酸拷貝數(shù)高于PCV2單獨感染組，PCV2與PPV混合感染組PPV病毒核酸拷貝數(shù)在60hpi后顯著高于PPV單獨感染組;PCV2單獨感染組和PPV單獨感染組IFN-γmRNA表達水平上調(diào)，PCV2與PPV單獨感染組IFN-γmRNA表達表達水平下調(diào);病毒感染后都可引起TNF-αmRNA表達水平的上調(diào)，36hpi前PCV2感染

7、起主要作用，48hpi后PPV感染起主要作用，PCV2與PPV混合感染TNF-αmRNA明顯高于單獨感染姐;在24hpi、36hpi，PCV2和PPV單獨感染可引起IL-10 mRNA表達水平的上調(diào)，PCV2與PPV混合感染后在36hpi、48hpi、IL-10mRNA表達水平顯著上調(diào)，其它時間不顯著。
　　3.PCV2與PPV混合感染對3D4/21細胞的影響
　　本研究通過PCV2和PPV混合感染3D4/21細胞后，檢測感

8、染后不同時間PCV2和PPV病毒核酸拷貝數(shù)及IFN-γ，TNF-α，IL-10mRNA表達的動態(tài)變化，分析PCV2和PPV混合感染對細胞免疫反應的影響。將3D4/21細胞分為4組:PPV單獨感染組、PCV2單獨感染組、PCV2與PPV混合感染組、對照組。在接種病毒12h、24h、36h、48h、60h、72h各時間點提取病毒DNA及3D4/21細胞總RNA。用已經(jīng)建立的real-time PCR法檢測各組中病毒核酸拷貝數(shù)及IFN-γ，T

9、NF-α，IL-10 mRNA表達的動態(tài)變化。結(jié)果顯示，PCV2和PPV混合感染后，PCV2與PPV單獨感染組PCV2病毒核酸拷貝數(shù)和PPV病毒核酸拷貝數(shù)分別于36hpi和24hpi高于單獨感染組;PPV單獨感染組IFN-γmRNA表達水平高于PCV2單獨感染組IFN-γ mRNA表達水平，PCV2與PPV單獨感染組IFN-γmRNA表達水平在12hpi時高于PCV2單獨感染組，24hpi后低于對照組及單獨感染組;PPV單獨感染組TNF

10、-αmRNA表達水平在24hpi后上調(diào)，PCV2單獨感染組TNF-αmRNA表達水平在24hpi后上調(diào)，在48hpi后高于PPV單獨感染組，PCV2與PPV單獨感染組TNF-αmRNA表達水平在36hpi后上調(diào)，并明顯高于單獨感染組;PCV2單獨感染組IL-10mRNA表達水平在24hpi及48hpi后輕微上調(diào)，PPV單獨感染組對IL-10 mRNA表達水平?jīng)]有影響，PCV2與PPV單獨感染組1L-10mRNA表達水平在24hpi后顯著