樹突細(xì)胞及神經(jīng)干細(xì)胞-前體細(xì)胞聯(lián)合移植修復(fù)大鼠脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、脊髓損傷(SpinAlCord Injury, SCI)造成明顯的功能喪失和神經(jīng)細(xì)胞的死亡。雖然脊髓內(nèi)源性神經(jīng)干/祖細(xì)胞(NeurAlStem/Progenitor Cells，NSPCs)位于于中央管周圍的室管膜區(qū)，能夠增殖和分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)，但哺乳動物脊髓內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞/祖細(xì)胞的再生能力似乎是有限的，并且其分化形成新的細(xì)胞的數(shù)量較少。胚胎及新生哺乳動物的腦存在大量的NSPCs，有自我更新及向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的能力。由于這

2、些優(yōu)勢，外源性NSPCs 常常被用于脊髓損傷修復(fù)治療研究，許多實(shí)驗(yàn)表明NSPCs移植能夠明顯改善神經(jīng)功能。體內(nèi)移植NSPCs，由損傷區(qū)向周圍遷移，存活并向星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元分化，最后整合入宿主組織參與損傷脊髓的修復(fù)。樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)是專職的抗原提呈細(xì)胞，在激發(fā)和調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。Schwartz等提出了神經(jīng)變性狀態(tài)下“保護(hù)性自身免疫”的概念。Huaben 報道負(fù)載髓磷脂堿性

3、蛋白的DC 局部或系統(tǒng)移植明顯促進(jìn)大鼠運(yùn)動功能恢復(fù)。Mikami等報道SCI后局部移植脾來源的樹突細(xì)胞能促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，并且促進(jìn)內(nèi)源性NSPCs 活化參與新的神經(jīng)發(fā)生。在我們前期的研究觀察到，局部或系統(tǒng)注射負(fù)載脊髓勻漿蛋白(homogenate protein of spinAlcord，hp)的DCs(hpDC)能明顯促進(jìn)SCI小鼠的功能恢復(fù)，與負(fù)載髓磷脂堿性蛋白的DC 相比，負(fù)載脊髓勻漿蛋白有更好的療效。我們課題組還觀察到脊髓勻漿

4、蛋白負(fù)載DCs組神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin表達(dá)延長。Huaben等認(rèn)為DCs的神經(jīng)保護(hù)作用它通過激活T細(xì)胞參與實(shí)現(xiàn)的。體內(nèi)T細(xì)胞的活化為神經(jīng)干細(xì)胞創(chuàng)造了一個內(nèi)源性NSPCs 存活并分化的良好條件。但是DCs與NSPCs之間的相互作用目前尚不清楚。
　　 我們假設(shè)DCs和NSPCs 聯(lián)合移植能夠促進(jìn)運(yùn)動功能恢復(fù)，且可能比單純一種細(xì)胞移植的治療效果更好。我們采用eGFP 轉(zhuǎn)基因新生大鼠腦來源的NSPCs作為標(biāo)記細(xì)胞著重觀察神經(jīng)干細(xì)

5、胞的存活情況。為避免損傷急性期對細(xì)胞的存活影響，在損傷后9天局部移植細(xì)胞，84天后采用BBB 評分法評價運(yùn)動功能恢復(fù)情況，采用組織病理學(xué)及免疫熒光方法觀察組織損傷變化。并通過體外將兩種細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，觀察了NSPCs的增殖變化及共培養(yǎng)體系的神經(jīng)營養(yǎng)因子的變化情況，從而探討DCs與NSPCs可能的相互作用機(jī)制。
　　 材料與方法：
　　 1.大鼠脊髓損傷模型的制備及細(xì)胞移植
　　 Basso 法制作打擊損傷模型(1

6、0g，20mm，NYU，USA)，造成T9 節(jié)段中度挫傷。80只10～12周齡SPF級SD大鼠，體重200～250g。制模成功9天后進(jìn)行進(jìn)行BBB評分，評分≤5 入選實(shí)驗(yàn)分組。入組SD大鼠 根據(jù)細(xì)胞移植分四組HBSS組、DCs組、NSPCs組、DCs+NSPCs組。局部分別注射HBSS 或細(xì)胞懸液5ul，DCs1×106個，NSPCs2×104個，每組20只。9天后，再次打開椎管，立體定位儀固定大鼠，漢密爾頓注射器吸取5ul細(xì)胞懸液，在

7、脊髓損傷局部穿刺入1.5mm，緩慢注射5min(總量DCs 1×106；NSPCs 2×104）。
　　 2.未成熟DCs的制備及MBP及OVA抗原負(fù)載未成熟DCs 來源于SD大鼠骨髓，參照Hauben [2]法。取4-6周SD大鼠歸骨髓細(xì)胞，培養(yǎng)7天，收集細(xì)胞獲得未成熟DCs。加入MBP 或OVA 負(fù)載2小時，制備成熟的mbpDCs及ovaDCs。
　　 3.新生SD大鼠全腦神經(jīng)干細(xì)胞的制備
　　 NSPCs

8、來源于增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorescence Protein，EGFP)轉(zhuǎn)基因或普通新生SD大鼠(1-3天)全腦，參照Laura [3]法。第7天收集神經(jīng)球用于實(shí)驗(yàn)。胰酶消化法傳代。
　　 4.免疫細(xì)胞熒光術(shù)
　　 將收集的懸浮細(xì)胞球、細(xì)胞爬片、組織切片進(jìn)行入4％多聚甲醛固定，根據(jù)實(shí)驗(yàn)濃度加入一抗4 ℃過夜，二抗在37 ℃ 孵育2小時，DAPI 或Hochest 染核。中性樹脂封片，激

9、光共聚焦顯微鏡或普通熒光顯微鏡檢測。
　　 5. 脊髓損傷神經(jīng)功能評估
　　 移植后1月內(nèi)每2天評分1次，1月后每周評分1次，采用雙盲法進(jìn)行BBB后肢運(yùn)動評分。
　　 6. 脊髓標(biāo)本的取材、切片制備、HE 染色
　　 以脊髓損傷區(qū)為中心取脊髓1.5cm，連續(xù)縱行切片(5μm)防脫載玻片撈片，間隔2張撈片，每個脊髓標(biāo)本裱為十套，取第一與第六套切片行HE 染色，觀察記錄損傷部位情況，觀察損傷后損傷區(qū)病理變化及

10、病變結(jié)構(gòu)。常規(guī)HE 切片染色。
　　 7．DCs與NSPCs 共培養(yǎng)
　　 采用24孔板，細(xì)胞濃度及數(shù)量為：DCs、mbpDCs、ovaDCs 1×106/ml，600ul；NSPCs 1×103/ml，100ul。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，為觀察兩細(xì)胞相互直接及間接影響，分隔培養(yǎng)采用懸掛式培養(yǎng)小室，用“/”表示，上層為DCs，下層為NSPCs。分為以下組：NSPCs組、DCs組、DCs+NSPCs組、DCs/NSPCs組、mbpD

11、Cs+NSPCs組、mbpDCs/NSPCs組、ovaDCs+NSPCs組、ovaDCs/NSPCs組。培養(yǎng)第24、48、72小時分別收集上清待測。培養(yǎng)第7天進(jìn)行神經(jīng)球計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)采用顯微鏡拍攝后測量直徑，直徑大于或等于50um的納入統(tǒng)計(jì)。
　　 8．DCs與NSPCs 共培養(yǎng)上清NGF、NT-3、BDNF的ELISA 檢測
　　 方法參照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行(武漢博士德公司)。
　　 9．統(tǒng)計(jì)分析

12、　　 本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。樣本算術(shù)平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差、概率值分別以s x±、p表示，同一時點(diǎn)BBB 評分采用單因素ANOVA分析，多點(diǎn)評分采用重復(fù)測量統(tǒng)計(jì)分析，損傷區(qū)范圍、空洞面積，細(xì)胞因子濃度、陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)采用單因素ANOVA分析、兩獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)（雙側(cè)）或配對T 檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果：
　　 1．運(yùn)動功能恢復(fù)情況：大鼠在建模后均出現(xiàn)完全性截癱，14天后DCs+NSPCs組較NSPCs組增

13、加(P<0.05)。NSPCs組、DCs組、HBSS組在28天后進(jìn)入平臺期，DCs+NSPCs組BBB 評分繼續(xù)緩慢增加，42天后進(jìn)入平臺期。移植84天后DCs+NSPCs組、NSPCs組、DCs組、HBSS組評分分別為11.70±0.99、9.75±0.50、7.40±0.93、5.93±0.78。統(tǒng)計(jì)顯示DCs+NSPCs組較其他三組差異明顯(p＜0.05)，NSPCs組較DCs組、HBSS組差異明顯(p＜0.05)，DCs組和HB

14、SS組評分無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 2．病理組織學(xué)檢查：細(xì)胞移植84天后，DCs+NSPCs組損傷區(qū)范圍6.84±0.31mm2，局部空洞面積0.96±0.23mm2；NSPCs組損傷區(qū)范圍6.91±0.30mm2，局部空洞面積1.82±0.19mm2；DCs組損傷區(qū)范圍7.55±0.14mm2，局部空洞面積1.62±0.12mm2；HBSS組損傷區(qū)范圍8.23±0.26mm2，局部空洞面積2.33±0.39mm2。從損傷區(qū)范圍分析

15、，DCs+NSPCs組與NSPCs組無明顯差異，DCs+NSPCs組較DCs組、HBSS組小(p＜0.05)；NSPCs組較DCs組、HBSS組差異明顯(p＜0.05)；DCs組較HBSS組差異明顯(p＜0.05)。
　　 3．EGFP 陽性NSPCs 局部移植兩周后存活情況：DCs+NSPCs組(57.33±5.13，n=3)NSPCs 存活數(shù)量較NSPCs組(33.33±6.11，n=3)明顯增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05

16、)。
　　 4．體外NSPCs和mbpDCs、ovaDCs、DCs 共同培養(yǎng)促進(jìn)了NSPCs 增殖：mbpDCs+NSPCs(13.5±3.06)組神經(jīng)球數(shù)量明顯多于NSPCs組(5.5±0.58) (P<0.01)；mbpDCs/NSPCs組(75.20±14.58) (P<0.05)及ovaDCs/NSPCs組(81.23±13.10) (P<0.01)神經(jīng)球的直徑較NSPCs組明顯增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5．

17、神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)：體外共培養(yǎng)體系中的BDNF、NT-3表達(dá)上調(diào)；體內(nèi)細(xì)胞治療后兩周組織切片免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明，DCs+NSPCs組(233734.24±19373.58 μm2，n=5)損傷位點(diǎn)NT-3表達(dá)上調(diào)，與比較HBSS組(119042.21±10130.23 μm2）、DCs組(128985.04±8342.58 μm2）、NSPCs組(169729.32±12091.18 μm2）具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　

18、 結(jié)論：
　　 1．本實(shí)驗(yàn)證明，DCs 聯(lián)合NSPCs 移植促進(jìn)了T9 SCI大鼠的后肢運(yùn)動功能的恢復(fù)，較單獨(dú)移植NSPCs 效果好。
　　 2．DCs 移植能夠減少了損傷區(qū)范圍及空洞形成，NSPCs 移植進(jìn)一步減少損傷區(qū)范圍。聯(lián)合移植進(jìn)一步減輕脊髓組織損傷程度。
　　 3．在體內(nèi)DCs 促進(jìn)NSPCs 存活，提示DCs對NSPCs的具有調(diào)控作用。聯(lián)合移植促進(jìn)運(yùn)動功能恢復(fù)的作用可能是通過DCs 調(diào)控NSPCs 來

19、實(shí)現(xiàn)的。
　　 4．在體外DCs 促進(jìn)NSPCs的增殖，共培養(yǎng)各組總體趨勢是促進(jìn)了NSPCs的增殖。成熟DCs對NSPCs的增殖促進(jìn)作用更為明顯。不同抗原對樹突細(xì)胞的作用無特異性。
　　 5．DCs能夠表達(dá)BDNF、NT-3；體外未成熟與成熟DCs與NSPCs 共培養(yǎng)上清中BDNF、NT-3表達(dá)上調(diào)；聯(lián)合細(xì)胞移植2周后脊髓損傷位點(diǎn)NT-3表達(dá)上調(diào)。提示神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)上調(diào)可能是DCs 調(diào)控NSPCs，促進(jìn)脊髓修復(fù)的內(nèi)在