中慢生型天山根瘤菌中MrtR蛋白的融合表達、鑒定及其功能的初步研究.pdf

1、在根瘤菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)中，調(diào)控蛋白是通過與信號分子相互作用的模式來行使其群體效應(yīng)功能的。在各種根瘤菌中廣泛存在LuxR/I類群體感應(yīng)系統(tǒng)，并且種類繁多，目前已發(fā)現(xiàn)的包括CinR/I，RaiR/I，RhiR/I，TraR/I，SinR/I等，分別調(diào)節(jié)根瘤菌的不同生理功能。本實驗室在中慢生型天山根瘤菌中首次發(fā)現(xiàn)了MrtR/I系統(tǒng)，其中mrtI基因負責(zé)合成AHLs分子，而且只有在具有很高AHLs活性的野生型菌株的上清存在的情況下mrtI基因才

2、能夠被誘導(dǎo)表達，研究還發(fā)現(xiàn)mrtR基因的缺失會影響AHLS分子的產(chǎn)生，因此我們推測MrtR蛋白通過調(diào)控mrtI基因從而影響AHLs分子的產(chǎn)生。 采用PCR技術(shù)從含有mrtR/I的質(zhì)粒pHMZ981中擴增mrtR基因片段，凝膠電泳結(jié)果顯示，擴增出850bp左右的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。將PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHI和EcoRI酶切、純化、回收后，插入原核表達載體pALEx中，重組表達載體命名為pDJ1，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(

3、DE3)菌株的感受態(tài)細胞，重組菌命名為BL21(DE3)(pDJ1)。 原核表達重組菌BL21(DE3)(pDJ1)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)及表達條件的優(yōu)化后，SDS-PAGE結(jié)果表明，GST-MrtR融合蛋白成功得到了表達。將其表達產(chǎn)物經(jīng)超聲波裂解，高速離心分離上清和沉淀， SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，BL21(DE3)(pDJ1)表達產(chǎn)物GST-MrtR同時以可溶性蛋白和包涵體兩種形式存在。過柱純化GST-MrtR，純化產(chǎn)物濃度達1

4、mg/ml以上。 將純化好的GST-MrtR與等量弗氏完全佐劑乳化，注射8周齡的Balb/C鼠，50μg/只，以后每隔2周用等量弗氏不完全佐劑乳化，加強免疫2次，劑量同首免，第3次免疫后10天采血，分離血清，采用間接ELISA法檢測所得到的抗體效價達到1:262000。用制備的GST-MrtR多克隆抗體對融合蛋白及非融合表達的MrtR蛋白進行Westcrn blot分析，均呈現(xiàn)特異性的結(jié)合條帶,表明所制備的抗體具有較好的抗體活性