苜蓿中華根瘤菌Sm2011 Tn5--sacB插入突變體庫的構(gòu)建及共生相關(guān)突變體的篩選.pdf

1、豆科植物與根瘤菌共生形成一個特殊的器官-根瘤，根瘤是根瘤菌共生固氮的場所，其形成和發(fā)育都是根瘤菌與宿主植物相互作用的結(jié)果。在豆科植物中，存在兩種不同形態(tài)的根瘤:即定型根瘤和不定型根瘤。定型根瘤的分生組織活性周期短，且根瘤各個組織的發(fā)育階段一致;不定型根瘤的分生組織活性延續(xù)時間長，根瘤菌則持續(xù)感染其分生組織，導(dǎo)致根瘤有明確的分生區(qū)、侵染區(qū)、固氮區(qū)和衰老區(qū)，各個區(qū)域處于不同的發(fā)育階段。模式豆科植物蒺藜苜蓿根瘤屬于不定型根瘤，其共生伙伴-苜蓿

2、中華根瘤菌在侵染區(qū)與固氮區(qū)間開始分化成類菌體并行使固氮功能。為了揭示根瘤菌在根瘤中侵染、存活、定殖分化及固氮的機(jī)制，本研究以中華苜蓿根瘤菌Sm2011菌株為材料，開展了共生固氮相關(guān)基因突變體分離和鑒定的工作，主要研究結(jié)果如下:
　　1.構(gòu)建了苜蓿中華根瘤菌Sm2011菌株的突變體庫:利用三親本雜交技術(shù)，以Sm2011為受體，以E.coli S17-1/pMH1701為供體、E.coli/pRK2073作為輔助菌進(jìn)行三親本雜交。其結(jié)

3、果表明，Tn5-sacB轉(zhuǎn)座頻率為1.84×10-6，經(jīng)Km抗性、蔗糖敏感及Tc抗性篩選，分離得到約8000株根瘤菌Tn5-sacB插入突變體。隨機(jī)挑選23個單菌落，通過PCR證實Tn5-sacB插入在根瘤菌基因組。
　　2.篩選根瘤菌抑制苜蓿根瘤免疫相關(guān)基因的突變體:蒺藜苜蓿抑制根瘤免疫基因突變體（nad1），在接種野生型根瘤菌時，形成不能固氮根瘤（白色）。利用該突變體的根瘤表型，接種Tn5-sacB插入突變的根瘤菌，嘗試篩選出

4、能形成粉紅色的根瘤。結(jié)瘤實驗結(jié)果表明，在約1600棵nad1缺陷型植株中，未發(fā)現(xiàn)有結(jié)粉紅色根瘤的植株。說明利用該方法難以篩選到根瘤菌恢復(fù)nad1突變體結(jié)固氮根瘤的表型。
　　3.苜蓿根瘤菌共生固氮相關(guān)基因突變體的分離和鑒定:利用巢式PCR檢測技術(shù)，從約8000株根瘤菌Tn5-sacB插入突變體庫中鑒定和篩選出4個特定目標(biāo)基因的插入位點及其突變體，即固氮酶基因nifH-75-9，結(jié)瘤基因nodC-32-33，肽聚糖相關(guān)基因smc04

5、024-76-79和smc01188-11-80，其中只有smc04024的插入位點位于基因F端上游，其他三個突變體中Tn5均插入在基因序列中。通過結(jié)瘤實驗，考察突變體共生及固氮表型，得到野生型苜蓿種子接種nifH基因突變體28d后，形成不能固氮根瘤（白色）;接種nodC基因突變體10d后，不能形成根瘤。該結(jié)果與已經(jīng)報道的結(jié)果完全一致，證實了突變體庫的完整性。而在接種smc01188基因突變體28d后，所得到的根瘤雖然呈粉紅色，但紅色區(qū)