高氮條件下microRNA528調控玉米倒伏的機制研究.pdf

1、為了獲得高產(chǎn)，農(nóng)民往往過量施用氮肥。氮肥的大量使用，不僅導致氮肥利用效率降低、環(huán)境污染等，還容易引起作物倒伏，但其中的機制有待于破解。實驗室前期對缺氮處理的玉米幼苗組成的小RNA文庫進行測序，發(fā)現(xiàn)ZmmiR528能夠響應氮脅迫。miR528是特定單子葉植物所特有的，雖有研究表明miR528在水稻中通過作用于L-抗壞血酸氧化酶參與病原菌免疫反應，但miR528在玉米中的靶基因與水稻明顯不同，暗示miR528在玉米中有不同功能。因此，本論文

2、通過分子生物學、細胞生物學等技術手段，深入研究miR528在玉米中的功能。主要實驗結果如下:
　　1、通過硫代酸解法和乙酰溴法對不同氮處理條件下玉米苗期木質素組成和含量進行測定，我們發(fā)現(xiàn)在高氮條件下，地上部產(chǎn)生的p-香豆醇H、松柏醇G和芥子醇S單體減少，S/G比值降低，木質素總含量降低;而在低氮條件下，產(chǎn)生的H、G和S單體增加，S/G比值升高，木質素總含量增加。
　　2、Stem-loop RT-qPCR結果顯示，在高氮條件

3、下，ZmmiR528上調表達，而在低氮條件下，ZmmiR528下調表達，與木質素對氮響應恰好相反。
　　3、對ZmmiR528的預測靶基因進行定量，在不同氮處理條件下，我們發(fā)現(xiàn)ZmLAC3和ZmLAC5與ZmmiR528表達呈相反趨勢，暗示ZmLAC3和ZmLAC5可能是玉米ZmmiR528的真實靶基因，煙草瞬時表達和5'-RACE實驗進一步驗證了此假設。
　　4、熒光定量結果顯示，ZmmiR528在玉米成熟期葉片中高度表達

4、，莖桿中度表達，根中表達量最低，而ZmLA C3表現(xiàn)出與ZmmiR528完全相反的表達趨勢。ZmmiR528和ZmLAC5原位雜交結果顯示，ZmmiR528主要在莖桿維管束的韌皮部表達，而ZmLAC5主要在維管束的纖維組織中表達，進一步證明ZmmiR528對ZmLACs的負調控關系。
　　5、為進一步研究ZmmiR528的功能，我們構建了ZmmiR528的過表達及敲減轉基因玉米。在水培玉米苗期，ZmmiR528的表達量與木質素含量

5、呈負相關。因此，我們對高氮條件下轉基因玉米成熟期的倒伏性進行鑒定，與野生型及ZmmiR528敲減植株相比，ZmmiR528過表達植株更易倒伏，且莖桿穿刺力以及木質素含量均降低，但纖維素和半纖維素含量未發(fā)生變化，這些結果表明高氮條件下ZmmiR528通過影響木質素含量進而影響玉米倒伏性。
　　6、我們同時也構建了ZmmiR528的靶基因ZmLAC3的過表達轉基因玉米，在高氮條件下，ZmLAC3OE植株莖桿穿刺力和木質素含量增加了約1

6、0～20％，與ZmmiR528敲減植株表型一致。
　　7、野生型及ZmmiR528敲減玉米的轉錄組測序結果顯示，ZmPAL7和ZmPAL8在ZmmiR528敲減玉米中發(fā)生差異表達。定量結果顯示，ZmPAL7和ZmPAL8在ZmmiR528過表達植株中下調表達，而在敲減植株中上調表達，這一結果在ZmLAC3OE植株中也得到證實。ZmPAL7和ZmPAL8也受氮水平調控，在低氮條件下上調表達。對其它ZmPALs進行定量發(fā)現(xiàn)，ZmPAL