模擬失重條件下microRNA-494抑制成骨細胞分化作用機制的研究.pdf

1、空間長期重力環(huán)境的改變會引起機體多個系統(tǒng)的變化，包括骨質(zhì)疏松、肌肉萎縮、免疫系統(tǒng)功能不全、心血管系統(tǒng)適應性減弱等。通過物理訓練和營養(yǎng)補充等措施的實施可以緩解肌肉萎縮、提高心血管系統(tǒng)的適應性，然而，目前尚沒有辦法對抗微重力引起的宇航員骨質(zhì)流失，這是威脅長期進行太空工作宇航員身體健康的最主要因素之一。微重力導致骨質(zhì)流失速度大約為每月減少2％的骨礦物質(zhì)密度，相當于絕經(jīng)后婦女一年流失的骨量。研究表明，重力和機械負荷是保持骨骼完整性的重要因素，然

2、而微重力環(huán)境引起骨質(zhì)丟失的機制尚不完全清楚。已有的研究顯示，失重引起的骨量減少是因為骨形成與重吸收之間的平衡被破壞，骨質(zhì)形成減少，而重吸收保持正?；蛟黾?，最終導致了骨量丟失。由于成骨細胞分化是骨骼形成和維持骨量的關(guān)鍵步驟，所以目前被普遍接受的觀點認為微重力導致的骨丟失的主要原因是成骨的細胞分化障礙，但是導致成骨細胞分化障礙的分子機制并不完全清楚。
　　miRNA是一類長度約18-25nt的小分子RNA，存在于包括哺乳動物在內(nèi)的多種

3、有機生命內(nèi)。miRNA通過完全或不完全互補的方式結(jié)合于靶基因的mRNA的3’UTR，負向調(diào)控基因表達。大約超過30％的基因表達都受到miRNA的調(diào)控，表明miRNA調(diào)控基因表達這一現(xiàn)象是普遍存在的。miRNA在細胞增殖、分化、死亡等過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。許多研究認為，miRNA參與了對成骨細胞成骨過程的表達調(diào)控，是成骨細胞分化的重要的調(diào)節(jié)分子。
　　本研究中我們以BMP-2誘導小鼠間充質(zhì)多能前體細胞C2C12成骨分化為研究對

4、象，探討模擬失重狀態(tài)下，成骨細胞分化過程中miRNA表達譜的改變，進而研究miRNA在失重性骨丟失中的作用及其分子機制。本研究的主要發(fā)現(xiàn)和結(jié)果如下：
　　1.微重力抑制成骨細胞分化和成熟。我們首先在細胞水平上檢測微重力對成骨細胞分化的影響。我們將C2C12細胞置于回轉(zhuǎn)器培養(yǎng)，同時加入300ng/mlBMP-2誘導分化，對照組不加BMP-2刺激。72小時后，Real-timePCR檢測成骨細胞特異基因堿性磷酸酶（Alkalineph

5、osphatase，ALP）,骨鈣素（osteocalcin，OC）,骨保護素（osteoprotegerin，OPG）和Runx2，結(jié)果顯示，在模擬失重環(huán)境下，成骨細胞分化受到顯著抑制。成骨細胞分化過程有多條通路參與，我們檢測了微重力對部分通路相關(guān)分子表達的影響。我們按上述方法處理C2C12細胞，72小時后收集細胞裂解液，Westernblot結(jié)果顯示，微重力引起B(yǎng)MPR2、FGFR2、Runx2的蛋白表達降低。尾部懸吊能夠消除大鼠后

6、肢機械負荷，是研究模擬失重的良好動物模型。本研究中我們采用核素骨掃描檢測了懸吊大鼠骨質(zhì)形成。我們發(fā)現(xiàn)，與對照組大鼠相比懸吊大鼠骨和關(guān)節(jié)中99mTc-MDP的聚集明顯減少，而且差異隨懸吊時間延長而增大。該結(jié)果說明，微重力引起骨代謝減弱，骨生成減少。
　　2.微重力環(huán)境可以引起成骨細胞miRNA表達譜的改變。我們將C2C12細胞置于回轉(zhuǎn)器中模擬失重培養(yǎng)，模擬失重培養(yǎng)細胞與對照細胞均加入BMP-2誘導其向成骨方向分化。72小時后，收集細

7、胞提取總RNA并進行miRNA芯片檢測。miRNA芯片篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)了７個顯著差異表達的miRNA，其中表達上調(diào)的miRNA有2個，表達下調(diào)的miRNA有5個。Real-timePCR驗證結(jié)果與芯片結(jié)果基本一致，其中mmu-miR-494模擬失重后表達水平明顯升高，mmu-miR-18*,mmu-miR-122a,mmu-miR-301,andmmu-miR-340表達水平則顯著降低，但mmu-miR-143的表達與對照組相比無顯著差別。

8、生物信息學方法預測表達上調(diào)的miR-494的靶基因參與成骨細胞分化，因此我們將關(guān)注的焦點放在對miR-494的研究上。給予BMP-2處理的C2C12細胞在模擬失重0、2、4、8、12、24、48和72小時后分別收集細胞檢測miR-494表達水平的變化。我們發(fā)現(xiàn)，在模擬失重2小時，miR-494表達開始上升，并且隨著失重時間的延長，miR-494表達持續(xù)升高。此外，我們分離了懸吊大鼠股骨近側(cè)干垢端成骨細胞，檢測其中miR-494表達水平，

9、發(fā)現(xiàn)懸吊2周和４周的大鼠其成骨細胞內(nèi)miR-494表達均明顯上調(diào)，并隨懸吊時間的延長而持續(xù)升高。該實驗表明微重力環(huán)境能引起成骨細胞miRNA表達譜的改變，其中mmu-miR-494的升高十分顯著，且其表達水平與模擬失重的時間正相關(guān)。
　　3.miR-494抑制成骨細胞分化。為了驗證miR-494對骨形成的作用，我們首先檢測miR-494對細胞增殖和細胞周期的影響。我們將miR-494mimics及其相應陰性對照（N.C.）轉(zhuǎn)染C2

10、C12細胞和MC3T3-E1細胞，MTT實驗和流式細胞術(shù)分析結(jié)果表明，miR-494對細胞增殖和周期無明顯影響。進一步的研究顯示，在BMP-2存在時，miR-494能明顯抑細胞ALP活性，但未給予BMP-2刺激時，這種抑制效果不顯著，表明miR-494可能參與了對C2C12細胞成骨分化的抑制。隨后，我們用Reai-timePCR、ELISA和WesternBlot分別在mRNA水平和蛋白水平檢測了miR-494對成骨細胞特異基因ALP、

11、OC、OPG、Runx2表達的影響。與ALP染色和活性測定結(jié)果一致，轉(zhuǎn)染miR-494后細胞中ALPmRNA表達降低，而且無論是否存在BMP-2，OC、OPG和Runx2表達也有所下降。ELIAS分析結(jié)果顯示，過表達miR-494減少了細胞分泌OC和OPG。在BMP-2誘導下，Runx2蛋白表達上調(diào)，但是轉(zhuǎn)染miR-494后Runx2的上調(diào)被抑制。Osx是Runx2下游基因，我們發(fā)現(xiàn)在BMP-2誘導分化的C2C12細胞中過表達miR-4

12、94抑制了Osx的表達。另外，我們還發(fā)現(xiàn)在C2C12細胞中過表達miR-494后，其成肌分化的相關(guān)基因表達發(fā)生了上調(diào)，而miR-494對C2C12細胞成脂分化無明顯作用。我們的研究表明，miR-494能抑制細胞的成骨分化。
　　4.miR-494通過調(diào)節(jié)Runx2、BMPR2和FGFR2的表達抑制成骨細胞分化。我們用生物信息學方法在包括miRanda、TargetScan、pictar和RNAhybriddatabases等在內(nèi)的

13、多個網(wǎng)站進行miR-494靶基因預測，得到可能的靶基因超過1,000個。我們進一步從中篩選出參與成骨細胞分化的靶基因30個，并將這些基因3’UTR克隆入熒光素酶報告載體，與miR-494mimics或N.C.共轉(zhuǎn)染293A細胞，檢測其相對熒光強度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-494能顯著抑制BMPR2、FGFR2和Runx23’UTR報告基因的熒光素酶活性，且抑制效率達到40-60％。相反地，突變掉這些基因上miR-494的結(jié)合位點后，miR-4

14、94對熒光素酶活性的影響消失，表明miR-494可以結(jié)合并作用于上述基因的3’UTR。WesternBlot和Real-timePCR結(jié)果顯示，過表達miR-494明顯抑制內(nèi)源性BMPR2、FGFR2和Runx2的蛋白和mRNA表達。為了進一步確定miR-494是通過抑制BMPR2、FGFR2和Runx2的表達影響成骨細胞分化，我們合成了針對這3個基因的siRNA。將3種siRNA分別轉(zhuǎn)染C2C12細胞72小時，成骨細胞特異基因表達下調(diào)

15、，骨分化受抑制，其趨勢與轉(zhuǎn)染miR-494一致。我們的研究證明，miR-494通過直接下調(diào)和Runx2、BMPR2和FGFR2抑制成骨細胞的分化。
　　5.轉(zhuǎn)錄因子MyoD可能參與了對miR-494的表達調(diào)控。為了探討miR-494轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，我們對miR-494上游序列進行了生物信息學分析。分析結(jié)果顯示，距離pre-miR-4945’端2-3kb的上游序列在不同種屬中有高度的保守性，提示這段序列可能參與了對miR-494的轉(zhuǎn)錄

16、調(diào)控。進一步的分析表明該區(qū)域有多個Myod的結(jié)合位點，提示轉(zhuǎn)錄因子Myod可能參與了miR-494的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。我們首先分析了模擬失重時，BMP-2誘導分化的C2C12細胞中Myod表達情況，發(fā)現(xiàn)隨著失重時間的延長，Myod表達發(fā)生了上調(diào)，這與miR-494表達變化相一致。隨后，我們在正常重力條件下培養(yǎng)的C2C12細胞中加入BMP-2，研究細胞分化過程中mi-494與Myod表達變化情況，Real-timePCR結(jié)果顯示兩者表達水平隨誘導

17、時間的延長同時下降。此外，我們還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-494后，MyoD的表達水平也發(fā)生了上調(diào)。我們的研究初步顯示了轉(zhuǎn)錄因子MyoD可能參與了對miR-494的表達調(diào)控。為了證實我們的推測，進一步的的相關(guān)實驗還在深入進行中。
　　6.miR-494inhibitor能夠部分緩解失重引起的成骨分化障礙。模擬失重時成骨細胞分化受抑制，miR-494表達升高。我們將針對miR-494的反義寡核苷酸，即miR-494inhibitor及其相應對

18、照N.C.inhibitor分別轉(zhuǎn)染C2C12細胞，同時加入300ng/mlBMP-2誘導分化，置于回轉(zhuǎn)器模擬失重培養(yǎng)72小時，用Real-timePCR方法檢測細胞成骨相關(guān)基因表達，發(fā)現(xiàn)抑制miR-494的表達能夠使ALP染色增強，說明miR-494inhibitor能夠增加骨形成能力，部分緩解失重引起的成骨分化障礙。
　　總之，我們發(fā)現(xiàn)miRNA參與失重性成骨細胞功能異常的發(fā)生。其中，我們對表達上調(diào)的miR-494功能和作用機