炎癥或非炎癥條件下microRNA-101對(duì)細(xì)胞膽固醇外排影響的分子機(jī)制.pdf

1、目的：探討在炎癥或非炎癥條件下microRNA-101(miR-101)對(duì)人單核巨噬細(xì)胞（THP-1）和人肝癌細(xì)胞（HepG2）膽固醇外排的影響，為揭示miR-101在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生中的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　材料與方法:構(gòu)建miR-101或Anti-miR-101慢病毒載體并建立高表達(dá)miR-101或Anti-miR-101細(xì)胞模型。使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)驗(yàn)證miR-101與三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ABCA1) m

2、RNA的3’非編碼區(qū)(3'UTR)互補(bǔ)結(jié)合，分組為野生型(WT)+Con-miR組、定點(diǎn)突變(SDM)+miR-101組與 WT+miR-101組。非炎癥條件下 THP-1與HepG2各分為對(duì)照組，miR-101組和Anti-miR-101組；炎癥條件下各分為對(duì)照組，miR-101組，Anti-miR-101組，IL-6組(0.2％BSA+20ng/ml IL-6)，TNF-α組(0.2%BSA+25ng/ml TNF-α)，IL-6+

3、miR-101/Anti-miR-101組及 TNF-α+Anti-miR-101組。各組再根據(jù)是否用 LDL(0.2%BSA+25μg/ml LDL)處理，分為L(zhǎng)DL負(fù)荷和無(wú)LDL負(fù)荷。采用oil red O染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積，酶法測(cè)定胞內(nèi)膽固醇含量，熒光標(biāo)記膽固醇法(BODIPY-cholesterol)檢測(cè)載脂蛋白 A-I(apoA-I)介導(dǎo)的膽固醇外排。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)miR-101基因表達(dá)，Western

4、Blotting檢測(cè)ABCA1蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　在結(jié)合位點(diǎn)2，與 WT+Con-miR組和 SDM+miR-101組比較， WT+miR-101組ABCA13’ UTR活性顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。非炎癥狀態(tài)，THP-1和HepG2在有無(wú)LDL負(fù)荷條件下，與對(duì)照組相比，miR-101組的ABCA1蛋白表達(dá)顯著降低，apoA-I介導(dǎo)的細(xì)胞膽固醇外排明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Anti

5、-miR-101組 ABCA1蛋白表達(dá)明顯增加，apoA-I介導(dǎo)的細(xì)胞膽固醇外排顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。miR-101組或 Anti-miR-101組分別可以促進(jìn)或減少THP-1和HepG2胞內(nèi)膽固醇聚集，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在炎癥狀態(tài)下，與對(duì)照組比較，IL-6組與TNF-α組HepG2 miR-101表達(dá)顯著增加，IL-6組THP-1 miR-101表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與I

6、L-6組和TNF-α組比較，IL-6+Anti-miR-101組與TNF-α+Anti-miR-101組THP-1和HepG2 ABCA1蛋白表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　miR-101通過(guò)與ABCA1基因3’ UTR端互補(bǔ)結(jié)合下調(diào)細(xì)胞ABCA1蛋白表達(dá)抑制膽固醇外排；炎癥可以使細(xì)胞 miR-101表達(dá)增加并增強(qiáng)miR-101促進(jìn)膽固醇聚集的作用；下調(diào)細(xì)胞miR-101表達(dá)可以減輕炎癥對(duì)A