載VCM—SOL緩釋系統(tǒng)人工股骨頭的研制及生物毒性評(píng)估.pdf

1、背景
　　 人工髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后感染的治療十分棘手,臨床流行的治療方法，無論是全身大劑量、聯(lián)合使用抗生素，還是一、二期翻修手術(shù)，雖然可清除大部分細(xì)菌，卻均因?yàn)榭股夭荒芡黄萍?xì)菌在人工髖關(guān)節(jié)假體表面形成的生物被膜，難以徹底殺菌。常用的含抗生素骨水泥由于在假體局部、內(nèi)在釋抗放生素，取得了一定效果，但是抗生素骨水泥的有效釋放時(shí)間短、效價(jià)低、效果不穩(wěn)定、難吸收、對(duì)年輕和骨質(zhì)較好者不合適等缺陷限制了其發(fā)展。目前國(guó)內(nèi)、外的研究聚焦在一、二期的

2、人工髖關(guān)節(jié)翻修手術(shù)和局部載VCM—SOL 緩釋系統(tǒng)方面。
　　 硅溶膠是目前一種新型的載體材料，具有多孔的、可吸收的物理特性，生物毒性好，對(duì)組織和細(xì)胞的反應(yīng)與它的表面特性、降解率、以及與抗生素的合成有緊密關(guān)聯(lián)。相關(guān)體外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)硅溶膠具有極好的降解及控釋特性，釋放出來的抗生素抗菌性能可以得到保持。它也可被制作成片狀，顆粒狀，細(xì)粉狀，能作為內(nèi)植物的負(fù)載材料，也可以作為一種注射材料使用。國(guó)外學(xué)者Shula Radin在與Tiffan

3、y Chen的合作中,通過體外實(shí)驗(yàn)觀察,證實(shí)了在室溫條件下,由硅溶膠負(fù)載的萬(wàn)古霉素具有釋放緩慢,作用持久的作用,通過不同濃度配比研究，證實(shí)了硅溶膠作為一種抗生素負(fù)載材料，其降解和控釋的特性可以通過對(duì)硅溶膠的加工參數(shù)和抗生素與硅溶膠的濃度之比進(jìn)行調(diào)控，而達(dá)到臨床治療的需要。將抗生素藥物載體緩釋系統(tǒng)與人工髖關(guān)節(jié)假體相結(jié)合，從而使抗生素在局部得到釋放，達(dá)到殺菌、抑菌的目的，可能是未來假體置換術(shù)后預(yù)防感染的發(fā)展趨勢(shì)。這種特殊的抗生素假體必須做到

4、生物毒性、骨誘導(dǎo)、骨傳導(dǎo)、可塑性、緩釋性、力學(xué)強(qiáng)度的較完美結(jié)合。硅溶膠作為一種良好的抗生素藥物載體，在臨床上已經(jīng)開始得到了運(yùn)用，但在對(duì)其與抗生素藥物濃度比值和生物穩(wěn)定性方面還需近一步研究。
　　 目的
　　 1．采用正硅酸乙酯酸化水解法制備硅溶膠，以其作為藥物載體,抗生素選擇萬(wàn)古霉素，制備載萬(wàn)古霉素硅溶膠(VCM－SOL)緩釋系統(tǒng)；探討其體外緩釋、降解性能。確定硅溶膠與萬(wàn)古霉素的濃度比例,及可注射硅溶膠-抗生素系統(tǒng)的釋放

5、時(shí)限窗口和濃度。
　　 2．載VCM—SOL 緩釋系統(tǒng)的體外抑菌研究，探討其在體外對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌作用；
　　 3．載VCM—SOL 緩釋系統(tǒng)的生物毒性評(píng)估；
　　 4.在原我們與重慶市機(jī)電研究所鑄造醫(yī)用不銹鋼兔股骨頭的基礎(chǔ)上，將皮下給藥系統(tǒng)與其相連接，改進(jìn)成為可注射載VCM—SOL 緩釋系統(tǒng)鈦合金人工兔股骨頭。
　　 方法
　　 1.載萬(wàn)古霉素硅溶膠(VCM－SOL)緩釋系統(tǒng)的體外緩釋及降解

6、性能測(cè)定：載萬(wàn)古霉素硅溶膠(VCM－SOL)緩釋系統(tǒng)的制備：采用正硅酸乙酯酸化水解法制備硅溶膠(SOL)，以其作為藥物載體負(fù)載萬(wàn)古霉素(VCM)，制備VCM濃度分別為10、20、30mg/ml的VCM-SOL 涂層。通過高效液相色譜方法測(cè)定VCM 體外釋放濃度，洗脫法考察涂層的體外降解行為。
　　 2.載VCM—SOL 緩釋系統(tǒng)的體外抑菌實(shí)驗(yàn)研究：選用第一步研究中最佳載藥濃度的載萬(wàn)古霉素硅溶膠(VCM－SOL)緩釋系統(tǒng)，采用溶膠

7、-凝膠法制備載VCM-SOL 涂層鈦鋼片,作為實(shí)驗(yàn)組,普通鈦鋼片作為對(duì)照組。⑴、利用紅外光譜分析系統(tǒng)(FT-IR)來分析實(shí)驗(yàn)組的表面基團(tuán)；⑵、選用金黃色葡萄球菌(S.A)作為試驗(yàn)菌，通過細(xì)菌計(jì)數(shù)進(jìn)行洗脫液抑菌實(shí)驗(yàn)；⑶、掃描電鏡檢測(cè)鈦鋼片表面細(xì)菌黏附實(shí)驗(yàn)；⑷、激光掃描共聚焦觀察實(shí)驗(yàn)組在體外對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜形成抑制的作用，對(duì)比觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的體外抗菌效果。
　　 3.載VCM—SOL 緩釋系統(tǒng)的生物毒性評(píng)估；⑴、生物毒性檢

8、測(cè)：根據(jù)現(xiàn)行的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T16886-1和醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)選擇指南(ISO 標(biāo)準(zhǔn)10993-1，1997)，選擇紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、全身急性毒性試驗(yàn)、骨內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)載萬(wàn)古霉素硅溶膠(VCM－SOL)緩釋系統(tǒng)的生物毒性。⑵、主要觀察指標(biāo)：體溫升高情況、紅細(xì)胞溶血率、胞相對(duì)增殖率及骨組織切片免疫組化。
　　 4.可注射載VCM—SOL 緩釋系統(tǒng)鈦合金人工兔股骨頭的研制：⑴、分別測(cè)定10只新西蘭大白兔左股骨頭直徑

9、、股骨頸長(zhǎng)度、頸干角和股骨髓腔寬度，設(shè)計(jì)和制作普通兔人工股骨頭假體；⑵、在已設(shè)計(jì)的抗生素人工髖關(guān)節(jié)的基礎(chǔ)上，與皮下給藥系統(tǒng)相連接，設(shè)計(jì)并制作兔的可注射硅溶膠-抗生素假體。
　　 結(jié)果
　　 1.載萬(wàn)古霉素硅溶膠(VCM－SOL)緩釋系統(tǒng)的體外緩釋及降解性能測(cè)定結(jié)果：載藥濃度為20mg/ml的VCM-SOL 具有良好的體外釋放和降解效果，第14天時(shí)洗提液中VCM濃度為5.47±1.36μg/ml，仍高于金黃色葡萄球菌的最小

10、抑菌濃度(1.56～3.12μg/ml)，其失重率為84.72％，而第14天時(shí)載藥濃度為10mg/ml及30mg/ml的VCM-SOL 洗提液中VCM濃度分別為1.46±0.53和1.03±0.21μg/ml，失重率分別為77.39％和96.08％。
　　 2.載萬(wàn)古霉素硅溶膠(VCM－SOL)緩釋系統(tǒng)的體外抑菌結(jié)果：⑴、在載藥硅溶膠的FTIR 光譜圖中，SiO2和VCM的主要吸收峰都在，說明硅溶膠可以通過表面Si-OH對(duì)萬(wàn)古霉

11、素產(chǎn)生有效地吸附；⑵、在104CFU和105CFU細(xì)菌濃度下,對(duì)照組的培養(yǎng)平板上都長(zhǎng)滿了金黃色葡萄球菌,菌落數(shù)目隨金黃色葡萄球菌濃度的增加而明顯增加。而實(shí)驗(yàn)組的培養(yǎng)平板上只出現(xiàn)了幾個(gè)散落的菌落, 提示在相同培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌濃度條件下，載VCM20-SOL 鈦合金鈦片的實(shí)驗(yàn)組對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用(P<0.01)；⑶、對(duì)照組的SEM 圖顯示，大量正常結(jié)構(gòu)形態(tài)的金黃色葡萄球菌黏附，并且細(xì)菌之間相互黏連,多數(shù)聚集成團(tuán)狀;實(shí)

12、驗(yàn)組表面顯示為大量棉花狀載藥涂層,黏附的細(xì)菌較為分散,大部分金黃色葡萄球菌被分解,細(xì)菌的球形結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破壞；實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組對(duì)金黃色葡萄球菌的黏附同樣有著明顯的抑制作用；⑷、借助CLSM 取得了與鈦片基底平面相平行的一系列生物膜水平斷層圖像，隨著時(shí)間的推移，對(duì)照組的紅光與綠光逐漸增強(qiáng)，表明大量的細(xì)菌開始粘附于鈦片表面，慢慢形成生物膜，而實(shí)驗(yàn)組中的載VCM20-SOL 鈦合金鈦片表面，僅可見散在的紅色熒光存在，且看不到明顯的綠色熒光。說

13、明了實(shí)驗(yàn)組的鈦合金鈦片對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的形成有一定的抑制作用。
　　 3.載萬(wàn)古霉素硅溶膠(VCM－SOL)緩釋系統(tǒng)的生物毒性評(píng)估結(jié)果：①抗生素釋放系統(tǒng)紅細(xì)胞溶血率為2.52％，低于陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)。②細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞相對(duì)增殖率與對(duì)照組比較無顯著性差別，毒性評(píng)分為0～1級(jí)。③骨內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)：骨組織內(nèi)抗生素緩釋系統(tǒng)可逐步降解，并逐漸被骨性組織替代，無排斥現(xiàn)象。
　　 4.根據(jù)所測(cè)股骨的各項(xiàng)參數(shù)，采用不銹鋼材料，制作出直

14、徑分別為7mm和8mm的兔人工骨股頭，柄長(zhǎng)15～17mm，頸長(zhǎng)2mm，頸干角120°。在已設(shè)計(jì)的抗生素人工髖關(guān)節(jié)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)并制作兔的可注射硅溶膠-抗生素假體，關(guān)節(jié)柄部有1個(gè)直徑1.8mm的空腔用于連接皮下給藥系統(tǒng)，周圍有10個(gè)直徑為1mm的微孔與其想通。
　　 結(jié)論
　　 1.載VCM—SOL 緩釋系統(tǒng)的制備效果滿意，具有明顯的緩釋和抑菌作用，其釋放速度和降解率可通過改變載藥濃度進(jìn)行控制；
　　 2.以硅溶膠