Kallistatin蛋白的哺乳動物表達、純化及單克隆抗體制作初探.pdf

1、學(xué)校代碼：10385分類號：研究生學(xué)號：密級：KallistatinKallistatin蛋白的哺乳動物表達、純化及單克隆抗體制作初探蛋白的哺乳動物表達、純化及單克隆抗體制作初探PreliminaryStudyonMammalKallistatinproteinexpression，purificationmonoclonalantibodyproduction作者姓名：孫丹丹孫丹丹指導(dǎo)教師：許瑞安許瑞安合作教師：學(xué)科：生物學(xué)（生物化學(xué)

2、與分子生物學(xué)）生物學(xué)（生物化學(xué)與分子生物學(xué)）研究方向：臨床診斷試劑盒的研發(fā)臨床診斷試劑盒的研發(fā)所在學(xué)院：生物生物醫(yī)學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)學(xué)院論文提交日期：二零二零一六年一六年三月二十八二十八日摘要I摘要人組織激肽釋放酶結(jié)合蛋白（Kallistatin，Kal），作為一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，在炎癥反應(yīng)、血管生成以及損傷修復(fù)等多種生理和病理過程中發(fā)揮著重要的作用。本課題組前期研究表明，Kal具有良好的抗肝纖維化的作用，可以抑制大鼠肝星狀細胞的活化，下調(diào)

3、星狀細胞中的α平滑肌肌動蛋白(αSMA)的表達，并且抑制H202誘導(dǎo)的星狀細胞活性氧的形成。同時發(fā)現(xiàn)Kal可以作為肝纖維化診斷指標來對肝臟健康狀況進行有效檢測，并申報國家專利。本研究是在Kal確定可以作為肝纖維化診斷試劑研發(fā)基礎(chǔ)上的自然延伸，旨在創(chuàng)建一個以Kallistatin為指標的肝纖維化分子診斷ELISA試劑盒。本研究根據(jù)國家衛(wèi)生部關(guān)于臨床診斷試劑盒制作標準來設(shè)計、推進。即當前臨床上所用試劑盒除了對抗體進行檢測外的試劑盒均為是使用

4、雙抗體夾心法，在檢測抗體上加入生物素鏈霉親合素系統(tǒng)。本研究首先采用畢赤酵母發(fā)酵法和哺乳動物表達獲取Kal蛋白。實驗結(jié)果顯示：畢赤酵母表達的Kal蛋白糖基化水平不足，與天然的蛋白質(zhì)有一定的差異，無法采用。故本研究采用酵母發(fā)酵和哺乳動物表達系統(tǒng)獲得的Kal蛋白進一步探索。本研究結(jié)果顯示：通過酵母發(fā)酵可獲得較高純度的重組Kal蛋白，使用該蛋白制作抗體時，發(fā)現(xiàn)其Kal蛋白免疫原性較差，所以進行免疫時使用40μgmL的Kal與弗氏佐劑1:1混合后