牛分枝桿菌MPB64蛋白的原核表達(dá)及單克隆抗體制備.pdf

1、分枝桿菌是一種革蘭氏陽性抗酸桿菌,許多為環(huán)境中常在菌.大多數(shù)菌株生長緩慢,有些能夠引起人和動物結(jié)核及結(jié)核樣疾病,這一類分枝桿菌組成了結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群,該菌有許多共同的抗原蛋白.MPB64蛋白是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群成員都合成分泌的一種早期濾液蛋白,是該復(fù)合群特異性的分泌蛋白,在菌株鑒定和疫苗研究中都有重要應(yīng)用. 本實驗為了制備MPB64.單克隆抗體. 根據(jù)Genbank中已發(fā)布的Mvcobacterium bovis AF2122

2、/97菌株的mpb64基因序列設(shè)計引物,以牛分枝桿菌ValleeⅢ菌株基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增出具有完整開放閱讀框架(ORF)的mpb64基因,連接到pET32a(+)中構(gòu)建原核表達(dá)載體,誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白(rMPB64).同時,將mpb64基因經(jīng)BamHi和EcoRI雙酶切后連接到真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)中,構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pc-mpb64,經(jīng)瞬時轉(zhuǎn)染鑒定該真核質(zhì)粒能夠在哺乳動物細(xì)胞SP2/0中表達(dá).以構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒

3、免疫BABL/c小鼠,采用聚乙二醇PEG介導(dǎo)脾細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合,用純化的rMPB64來篩選針對MPB64蛋白的單克隆抗體,陽性的細(xì)胞株用有限稀釋法進(jìn)行3～4次亞克隆,最終獲得3株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,命名為A2E5、B3G8和C5F10.對單克隆抗體亞型鑒定結(jié)果表明:A2E5為IgM亞型,輕鏈為λ鏈;B3G8和C5F10為lgG2a亞型,輕鏈為κ鏈.ELlSA試驗證實,3株單抗都能與純化的rMPB64以及純化

4、的牛分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白(PPD)反應(yīng),與本實驗室表達(dá)并純化的rMPB70-83-ESAT6不反應(yīng).Western blot分析表明,3株單抗都不能與經(jīng)SDS-PAGE變性電泳后轉(zhuǎn)移到NC膜上的rMPB64發(fā)生反應(yīng),認(rèn)為制備的單克隆抗體識別的可能是MPB64蛋白的構(gòu)象表位. 本實驗利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)和純化了重組蛋白rMPB64,并以此蛋白為篩選抗原,采用基因免疫的方法制備了3株能夠分泌針對MPB64蛋白的單克隆抗體