Ⅱ型豬圓環(huán)病毒ORF2基因的畢赤酵母真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá).pdf

1、豬圓環(huán)病毒是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的主要病原，除PMWS之外，與許多豬相關(guān)疾病的發(fā)生有關(guān)，如豬皮炎與腎炎綜合征(PDNS)、增生性壞死性肺炎(PNP)、豬呼吸道綜合征(PRDC)、繁殖障礙、先天性顫抖、腸炎等疾病，并且這些相關(guān)聯(lián)的豬的疾病已在全世界范圍內(nèi)發(fā)生和流行，死亡率10-30％不等。較嚴(yán)重的地區(qū)，豬場(chǎng)在暴發(fā)本病時(shí)死淘率高達(dá)40％左右，其危害和造成的重大經(jīng)濟(jì)損失顯而易見(jiàn)，現(xiàn)已被世界各國(guó)的獸醫(yī)與養(yǎng)豬業(yè)者公認(rèn)為本病是繼豬繁殖與呼吸

2、綜合征(PRRS)之后新發(fā)現(xiàn)的重要的豬傳染病。因此如何防制該病和盡早檢測(cè)該病已成為養(yǎng)豬生產(chǎn)面臨的新問(wèn)題。 豬圓環(huán)病毒屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，無(wú)囊膜，二十面體對(duì)稱(chēng)，核酸為共價(jià)閉合、環(huán)狀、單股DNA病毒。研究表明，PCV1和PCV2均含有兩個(gè)主要的開(kāi)放閱讀框，即ORF1和ORF2。其中ORF1編碼病毒的復(fù)制相關(guān)蛋白(ReP蛋白)，是PCV1、PCV2產(chǎn)生抗原交叉性的主要蛋白質(zhì)。ORF2編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白(Cap蛋白)，是PCV

3、1、PCV2的主要保護(hù)性抗原，在PCV1與PCV2間不發(fā)生交叉反應(yīng)，只有PCV20RF2蛋白可以被PCV2多抗識(shí)別。因而該蛋白可以作為檢測(cè)PCV2抗體的有力診斷工具.畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)兼具有原核和真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，不僅容易操作、耗時(shí)短、培養(yǎng)基廉價(jià)，而且最顯著特點(diǎn)為畢赤酵母易于高密度發(fā)酵，表達(dá)水平相當(dāng)高，另外，酵母細(xì)胞具有對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行類(lèi)似真核細(xì)胞的蛋白加工、折疊和翻譯后修飾等優(yōu)點(diǎn)，而且在分泌表達(dá)外源蛋白過(guò)程中，畢赤酵母本身幾乎不分泌蛋白

4、，所以雜蛋白少，使表達(dá)蛋白利于純化。因而，畢赤酵母為表達(dá)重組蛋白提供了一個(gè)良好的真核表達(dá)環(huán)境，可以使蛋白基因得到高效的表達(dá)并且特異性高，從而應(yīng)用在豬圓環(huán)病毒病的快速診斷當(dāng)中。 在本研究中，根據(jù)GeneBank中豬Ⅱ型圓環(huán)病毒(PCV2)序列，設(shè)計(jì)1對(duì)引物，并以提取的包含PCV2全基因組的DNA為模板，擴(kuò)增出含ORF2基因的片段(675 bp)，回收PCR產(chǎn)物，將其克隆入pMD-18T載體，獲得重組質(zhì)粒pMD-ORF2，通過(guò)酶切鑒

5、定和PCR鑒定，證實(shí)了所克隆的基因與目的基因大小一致。重組質(zhì)粒經(jīng)SnaBⅠ和AvrⅡ雙酶切，回收ORF2基因，與真核表達(dá)載體pPIC9K進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、克隆鑒定。然后，通過(guò)電轉(zhuǎn)化法將經(jīng)SalⅠ酶切線(xiàn)性化的pPIC9K-ORF2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中，利用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot免疫印跡分析電泳分析。結(jié)果表明成功的獲得了吉林株P(guān)CV2病毒的ORF2部分基因，獲得了完整開(kāi)放閱讀框架，其大小