生物可降解聚氨酯刺激響應(yīng)膠束的設(shè)計(jì)合成及細(xì)胞內(nèi)藥物釋放.pdf

1、聚氨酯是一種重要的多功能材料，已在生物醫(yī)用領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。例如傳統(tǒng)的聚氨酯作為生物穩(wěn)定性材料，被廣泛應(yīng)用于制造心臟瓣膜、導(dǎo)尿管、人造血管、假肢等植入性設(shè)備。生物可降解聚氨酯由于其優(yōu)良的可降解性，近年來被應(yīng)用于藥物釋放和組織工程等領(lǐng)域。目前報(bào)道的用于藥物釋放載體的生物可降解聚氨酯材料，大多含有酯鍵，碳酸酯鍵等基團(tuán)，它們的降解速度很慢，導(dǎo)致藥物釋放緩慢，這在一定程度上會降低藥效，增加細(xì)胞的耐藥性，不利于癌癥的治療。為了進(jìn)一步加快藥物在腫瘤

2、組織或者細(xì)胞內(nèi)的釋放，本論文通過在聚氨酯主鏈中引入酸不穩(wěn)定的縮醛鍵制備了pH敏感的聚乙二醇-聚氨酯（PEG/PU）嵌段聚合物，制備了載藥膠束，并用于抗癌藥物的細(xì)胞內(nèi)快速釋放。在此基礎(chǔ)上，論文還研究了cRGD靶向分子修飾的PEG/PU納米載體和雙重敏感PEG/PU納米載體的細(xì)胞內(nèi)吞，細(xì)胞內(nèi)釋放行為和抗癌效果。各章節(jié)內(nèi)容具體如下：
　　論文的第一章對納米藥物載體的分類，聚氨酯材料及其在生物醫(yī)用領(lǐng)域中的應(yīng)用，刺激響應(yīng)性納米粒的分類，靶向

3、納米載體的優(yōu)點(diǎn)和各種靶向配體的優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用進(jìn)行了簡單的介紹。
　　論文第二章研究了含有縮醛鍵的聚氨酯（PAU）的制備，三嵌段共聚物PEG-PAU-PEG的制備，及pH敏感PEG-PAU-PEG膠束用于抗癌藥物阿霉素（DOX）在細(xì)胞內(nèi)的快速釋放。首先，我們通過一步反應(yīng)合成了新型的含有兩個(gè)縮醛鍵的雙羥基酸敏感單體-對苯二甲縮醛-三羥基乙烷二醇（TPABTME）。然后，由TPABTME與賴氨酸二異氰酸酯（LDI）發(fā)生縮合反應(yīng)，經(jīng)烯丙醇封端

4、得到主鏈含有多個(gè)重復(fù)縮醛鍵的聚氨酯聚合物Ally-PAU-Ally。接著與末端巰基化的PEG通過自由基加成反應(yīng)得到三嵌段聚合物PEG-PAU-PEG。該聚合物在水中自組裝形成粒徑90-120 nm左右的膠束。在模擬內(nèi)涵體和溶酶體酸性條件下（pH4.0或5.0）縮醛鍵斷裂，導(dǎo)致膠束破壞，快速釋放出藥物。體外釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，載藥膠束的藥物釋放與pH密切相關(guān)。在pH4.0和5.0下，48小時(shí)內(nèi)載藥膠束的DOX釋放量分別接近95％和70%。而

5、在正常生理環(huán)境下（pH7.4），相同的時(shí)間內(nèi)DOX只釋放了30%。激光共聚焦實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pH敏感的PEG-PAU-PEG膠束可以高效快速地將阿霉素運(yùn)送并釋放到小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞和耐阿霉素人乳腺癌細(xì)胞MCF-7/ADR細(xì)胞內(nèi)。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在MCF-7/ADR細(xì)胞中PEG-PAU-PEG膠束組的DOX熒光強(qiáng)度比自由DOX·HCl組高10倍。MTT測試結(jié)果表明，PEG-PAU-PEG載藥膠束對RAW264.7細(xì)胞具有

6、較高的抗腫瘤活性，半致死量(IC50)為0.94-1.54μg/mL。對于耐藥MCF-7/ADR細(xì)胞，PEG-PAU-PEG載藥膠束的半致死量為7.36-9.58μg/mL，比自由DOX·HCl低10倍。同時(shí)，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，PEG-PAU-PEG空膠束具有良好的生物相容性，膠束濃度達(dá)到1.5 mg/mL時(shí)MCF-7/ADR細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞的存活率均在90%以上。這些結(jié)果表明，pH敏感PEG-PAU-PEG載藥膠束在細(xì)胞

7、內(nèi)疏水抗癌藥物的高效釋放及提高癌癥治療效果方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　論文第三章在第二章制備得到三嵌段共聚物PEG-PAU-PEG的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)合成了cRGD修飾的pH敏感生物可降解cRGD-PEG-PAU-PEG-cRGD膠束用于DOX在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞（U87 MG）中的靶向釋放。cRGD修飾的pH敏感膠束是由兩種聚合物，mPEG5k-PAU-mPEG5k和 cRGD-PEG6.5k-PAU-PEG6.5k-cRGD按照不同的比

8、例在水中自組裝形成的，其粒徑為117-128 nm。其中靶向聚合物cRGD-PEG6.5k-PAU-PEG6.5k-cRGD是用雙官能化的PEG(HOOC-PEG6.5k-SH)封端 PAU后，通過酰胺化反應(yīng)將靶向分子cRGD-NH2接到 PEG一端得到的。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和激光共聚焦實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該靶向膠束是通過受體介導(dǎo)方式靶向并內(nèi)吞到αvβ3過表達(dá)細(xì)胞U87 MG細(xì)胞中的。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明載DOX的靶向膠束對U87 MG細(xì)胞的抗癌活性隨

9、著表面cRGD含量的增加（0-30%）逐漸增加（半致死濃度為18.46-4.51μg/mL）。其中含有30%cRGD-PEG6.5k-PAU-PEG6.5k-cRGD的靶向膠束的半致死濃度為自由阿霉素鹽酸鹽（DOX·HCl）(2.36μg/mL)的2倍，比沒有靶向的載藥膠束低4倍。而空白靶向膠束膠束均具有良好的生物相容性。本章在第二章制備的載體的基礎(chǔ)上，通過表面偶聯(lián)cRGD多肽靶向分子，增加了腫瘤細(xì)胞對膠束的內(nèi)吞，提高了載藥膠束的藥效。

10、
　　本論文第四章設(shè)計(jì)合成了cRGD修飾的pH和還原雙重敏感PEG/PU三嵌段聚合物膠束用于抗癌藥物DOX的靶向治療。本章中，通過含有縮醛鍵的2，4，6-三甲氧基縮醛季戊四醇（TMBPE）單體與含有雙硫鍵的胱胺二異氰酸酯單體（CDI）發(fā)生縮合反應(yīng)，制備得到主鏈含有雙硫鍵、側(cè)鏈含有縮醛鍵的聚氨酯（SSPU(TMBPE)），與PEG偶聯(lián)后得到三嵌段聚合物 mPEG5k-SSPU(TMBPE)-mPEG5k。靶向聚合物cRGD-PEG6

11、.5k-SSPU(TMBPE)-PEG6.5k-cRGD的制備中采用雙官能化的PEG（NHS-PEG6.5k-NCO）封端 SSPU(TMBPE)，然后通過酰胺化反應(yīng)將靶向分子cRGD-NH2修飾到 PEG一端。兩種聚合物，mPEG5k-SSPU(TMBPE)-mPEG5k和cRGD-PEG6.5k-SSPU(TMBPE)-PEG6.5k按照不同的比例在水中自組裝形成表面含有不同cRGD密度的pH和還原雙重敏感的膠束。動態(tài)光散射測試結(jié)果

12、表明雙重敏感膠束在pH5.0下，只發(fā)生溶脹，而在pH5.0和10 mM GSH同時(shí)存在條件下，膠束先溶脹最后破壞成單分子鏈。體外釋放結(jié)果表明，pH5.0和10 mM GSH同時(shí)存在下，12小時(shí)內(nèi)載藥膠束的DOX累計(jì)釋放量達(dá)到100%，而同樣時(shí)間內(nèi)，PU(TMBPE)膠束在pH5下，釋放量僅為50%。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和激光共聚焦實(shí)驗(yàn)顯示該靶向膠束是通過受體介導(dǎo)方式靶向內(nèi)吞到αvβ3過表達(dá)細(xì)胞U87 MG中的。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，載DOX的靶向

13、膠束對U87 MG細(xì)胞的抗癌活性隨著表面cRGD含量的增加（0-30%）逐漸增加（半致死濃度為10.56-2.16μg/mL）。其中含有30%cRGD-PEG6.5k-SSPU(TMBPE)-PEG6.5k-cRGD的靶向膠束的半致死濃度為自由阿霉素鹽酸鹽（DOX·HCl）的1.3倍，比沒有靶向的載藥膠束低5倍。載DOX的SSPU(TMBPE)膠束的半致死量比 PU(TMBPE)膠束低1.5倍。而空白靶向膠束膠束均具有良好的生物相容性，