赭曲霉培養(yǎng)基篩選及AopacC基因?qū)ιL(zhǎng)和產(chǎn)毒調(diào)控的功能研究.pdf

1、赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）是由青霉屬和曲霉屬產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛分布在糧食、水果、飼料、咖啡和動(dòng)物性副產(chǎn)品中，被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）列為2B類潛在致癌物，嚴(yán)重威脅人類健康和食品安全。有效防控農(nóng)產(chǎn)品OTA污染的關(guān)鍵是解析OTA合成途徑及其合成調(diào)控機(jī)理。PacC作為pH調(diào)控通路中的關(guān)鍵因子，參與多種生命活動(dòng)，調(diào)控毒素合成，但目前對(duì)赭曲霉中PacC的功能研究尚未見報(bào)道。本文研究了赭曲霉在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特性

2、和AopacC基因在赭曲霉pH應(yīng)答中的作用，研究發(fā)現(xiàn)：
　　（1）赭曲霉在不同培養(yǎng)基上產(chǎn)毒差異較大：固體培養(yǎng)基中，赭曲霉在YES培養(yǎng)基上產(chǎn)毒量較高且菌絲發(fā)達(dá)，OTA達(dá)到36.09 ng/mm2培養(yǎng)基，可以用YES培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行赭曲霉生理特性的研究；天然培養(yǎng)基中，OTA產(chǎn)量最高的是玉米渣培養(yǎng)基，OTA產(chǎn)量達(dá)到251.67μg/g，可以用來(lái)進(jìn)行OTA毒理和產(chǎn)毒規(guī)律等研究；赭曲霉在液體培養(yǎng)基中的產(chǎn)毒十分微弱且只在YES培養(yǎng)基中產(chǎn)毒，OTA

3、產(chǎn)量?jī)H為15.39 ppb。此外，研究發(fā)現(xiàn)固體培養(yǎng)基上OTA的提取宜采用方便快捷、回收率高的甲醇直接提取法，而在液體中OTA的提取宜選用氯仿萃取法。
　?。?）本研究運(yùn)用同源重組原理和PEG誘導(dǎo)的方法對(duì)赭曲霉AopacC基因進(jìn)行敲除：通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得AopacC上下游片段和潮霉素片段，采用巢式PCR對(duì)三個(gè)片段進(jìn)行融合，將融合目的片段轉(zhuǎn)入赭曲霉原生質(zhì)體中，通過(guò)潮霉素抗性篩選，成功獲得赭曲霉3個(gè)轉(zhuǎn)化子，經(jīng)PCR鑒定均為非異位Aopa

4、cC突變體，分別命名為：⊿AopacC22-1、⊿AopacC-3、⊿AopacC-5。
　?。?）對(duì)AopacC進(jìn)行功能分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，⊿AopacC與野生型相比，生長(zhǎng)緩慢， OTA合成量減少，致病性顯著降低，并且呈現(xiàn)出pH依賴性。研究赭曲霉中全局調(diào)控基因和基因簇內(nèi)基因的表達(dá)情況時(shí)發(fā)現(xiàn)，與野生型對(duì)比，突變體中的OTA合成簇中的關(guān)鍵基因（Aopks，Aobzip，Aohalogenase）的表達(dá)都顯著下調(diào)，但是全局調(diào)控基因的表達(dá)在不同