斑馬魚(yú)tmp3,hprg1b和cxxc5基因在心臟發(fā)育中的功能研究.pdf

1、先天性心臟病是新生兒出生缺陷中發(fā)病率和死亡率最高的疾病，研究表明心臟發(fā)育調(diào)控基因的表達(dá)異常是導(dǎo)致先天性心臟病的內(nèi)在原因。闡明心臟在早期發(fā)育過(guò)程中的基因調(diào)控機(jī)制就成為治療先天性心臟病的關(guān)鍵。隨著斑馬魚(yú)成為研究發(fā)育生物學(xué)和功能基因組學(xué)的脊椎動(dòng)物模型，利用該模型可為探究心臟的早期發(fā)育和先天性心臟病發(fā)生的分子調(diào)控機(jī)制提供行之有效的研究策略。本文主要利用斑馬魚(yú)模型研究了tmp3，hprg1b和cxxc5基因在心臟早期發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控功能。

2、　　一、tmp3基因在心臟發(fā)育中的功能研究
　　tmp3基因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室早期克隆的一個(gè)心臟發(fā)育候選基因，本文利用Tol2轉(zhuǎn)座系統(tǒng)構(gòu)建了tmp3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的EGFP表達(dá)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)品系Tg(tmp3: EGFP)，簡(jiǎn)稱(chēng)tmp3EGFP。追蹤該轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)中EGFP的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，在受精后36，48和56小時(shí)(hpf) Tmp3蛋白主要強(qiáng)表達(dá)于心臟和骨骼肌中。原位雜交技術(shù)檢測(cè)EGFP早期表達(dá)信號(hào)發(fā)現(xiàn)在40％外包時(shí)，表達(dá)信號(hào)定位于卵裂球邊緣生心

3、區(qū);22體節(jié)時(shí)，信號(hào)定位于心錐和骨骼肌;24 hpf，信號(hào)定位于心管和骨骼肌;48 hpf，信號(hào)定位在骨骼肌和跳動(dòng)的心臟中。將Tg(tmp3: EGFP)魚(yú)與標(biāo)記心內(nèi)膜層細(xì)胞的Tg(fli1a: DSRED)魚(yú)及標(biāo)記心肌層細(xì)胞的Tg(myl7:DSRED)魚(yú)分別雜交，對(duì)發(fā)育到72 hpf的雙轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡單層切面掃描，結(jié)果顯示心臟中的tmp3基因表達(dá)只定位于心肌層。
　　利用TALEN打靶技術(shù)構(gòu)建的tmp3基因敲

4、除斑馬魚(yú)品系進(jìn)行Westernblot檢測(cè)證明，tmp3敲除陽(yáng)性個(gè)體中沒(méi)有相應(yīng)的功能型蛋白合成。觀察tmp3敲除純合子的表型發(fā)現(xiàn)，tmp3敲除斑馬魚(yú)表現(xiàn)為心包腫大，心臟腔室減小，環(huán)化異常和軀干發(fā)育異常。觀察Tg(myl7: DSRED;flk1:EGFP)雙轉(zhuǎn)基因tmp3敲除斑馬魚(yú)的表型發(fā)現(xiàn)，tmp3基因敲除導(dǎo)致斑馬魚(yú)心臟腔室減小和房室通道縮窄。為了探究心臟腔室的減小是由于心肌細(xì)胞大小的減小還是由于數(shù)目的減少導(dǎo)致的，利用細(xì)胞膜緊密連接蛋

5、白ZO-1的抗體標(biāo)記細(xì)胞膜，檢測(cè)tmp3敲除斑馬魚(yú)心臟細(xì)胞的大小，結(jié)果表明tmp3敲除魚(yú)心臟中的細(xì)胞大小并未發(fā)生顯著變化。另外，通過(guò)肌球蛋白重鏈MHC抗體和核內(nèi)DNA染料DAPI對(duì)心肌細(xì)胞染色并計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，48hpf tmp3敲除魚(yú)心臟中心肌細(xì)胞的數(shù)量顯著減少。證明tmp3基因敲除斑馬魚(yú)心臟腔室的變小是由于心肌細(xì)胞數(shù)量減少導(dǎo)致。Edu細(xì)胞增殖分析結(jié)果顯示tmp3基因敲除后增殖的幼魚(yú)心肌細(xì)胞數(shù)量顯著減少。而TUNEL凋亡細(xì)胞分析結(jié)果顯示tm

6、p3敲除幼魚(yú)心臟細(xì)胞的凋亡并未發(fā)生顯著變化。由此證明tmp3基因通過(guò)影響心肌細(xì)胞的增殖從而調(diào)控斑馬魚(yú)早期心臟發(fā)育。
　　本實(shí)驗(yàn)室早期通過(guò)酵母雙雜交和COIP相互作用分析篩選出與Tmp3蛋白相互作用的蛋白分子Creb2，那么Tmp3蛋白是否通過(guò)與Creb2相互作用從而調(diào)控心臟發(fā)育呢？本文利用免疫熒光和激光共聚焦掃描檢測(cè)斑馬魚(yú)胚胎心臟內(nèi)源Tmp3與Creb2蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)蛋白在72 hpf的幼魚(yú)心臟中存在共定位。進(jìn)一步的免疫熒

7、光實(shí)驗(yàn)證明在H9c2大鼠心肌細(xì)胞中TMP3蛋白與CREB2蛋白共定位于心肌細(xì)胞的細(xì)胞核中。接下來(lái)，用免疫熒光檢測(cè)了誘導(dǎo)向心肌細(xì)胞分化的P19小鼠畸胎瘤干細(xì)胞在誘導(dǎo)第6天和第10天內(nèi)源Tmp3和Creb2蛋白的定位。發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)第6天兩種蛋白大部分共定位在細(xì)胞質(zhì)中，而在誘導(dǎo)第10天這兩種蛋白共定位在細(xì)胞核中。提示隨著胚胎細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，Tmp3與Creb2兩種蛋白逐漸從細(xì)胞質(zhì)遷移到細(xì)胞核中，提示這兩個(gè)蛋白的入核進(jìn)程可能與心肌細(xì)胞的發(fā)育過(guò)

8、程相關(guān)。由于Tmp3是一個(gè)不具備入核信號(hào)的跨膜蛋白，為探究Tmp3是否依賴(lài)與Creb2的相互作用入核，構(gòu)建tmp3全長(zhǎng)熒光質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，而除去與Creb2相互作用結(jié)構(gòu)域(134-240AA)后的截短體蛋白Tmp3熒光質(zhì)粒僅定位在細(xì)胞質(zhì)中。由此證明，Tmp3蛋白是通過(guò)與Creb2蛋白相互作用介導(dǎo)入核的。
　　早期心肌細(xì)胞增殖和分化的關(guān)鍵調(diào)控因子gata4敲減的斑馬魚(yú)胚胎與tmp3基因敲除斑馬魚(yú)表現(xiàn)出類(lèi)似的

9、心臟缺陷表型，提示gata4可能是Tmp3-Creb2復(fù)合物的下游調(diào)控靶標(biāo)。本文利用RT-qPCR檢測(cè)了tmp3敲除斑馬魚(yú)胚胎中g(shù)ata4及其調(diào)控心肌細(xì)胞增殖的下游因子ccnd2a和cdk4拘表達(dá)。結(jié)果表明，gata4，ccnd2a和cdk4在tmp3敲除斑馬魚(yú)中均顯著下調(diào)。由此提示gata4可能是Tmp3-Creb2復(fù)合物的下游靶標(biāo)。另外在tmp3基因敲除斑馬魚(yú)一細(xì)胞期顯微注射gata4mRNA可以一定程度上拯救心臟的發(fā)育畸形，從而進(jìn)

10、一步證明gata4為T(mén)mp3-Creb2復(fù)合物調(diào)控早期心臟發(fā)育的下游靶標(biāo)。利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)法洛式四聯(lián)癥(TOF)病人心肌組織中TMP3 mRNA的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)TOF病人心肌組織中TMP3 mRNA的水平顯著下調(diào)。隨后通過(guò)測(cè)序分析在TOF病人中檢測(cè)到一個(gè)TMP3基因的錯(cuò)義突變(c.820C＞T，p.R274C)。將突變的TMP3質(zhì)粒(R274C，TMP3m)轉(zhuǎn)染到H9c2細(xì)胞中，利用熒光報(bào)告系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)GATA4基因的上游應(yīng)答元件

11、CRE-luc熒光報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性較野生型對(duì)照組顯著降低。而且western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TMP3m轉(zhuǎn)染的H9c2細(xì)胞中GATA4蛋白的表達(dá)量也顯著降低。由此可見(jiàn)，TMP3m突變可能通過(guò)影響GATA4蛋白的表達(dá)從而參與TOF的發(fā)病機(jī)制。
　　二、hprg1b基因在心臟發(fā)育中的功能研究
　　hprg1b基因是實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)果蠅P因子突變篩選出的另一個(gè)早期心臟發(fā)育候選基因。本文為了追蹤hprg1b基因在心臟早期發(fā)育過(guò)程中的

12、時(shí)空定位，利用Tol2轉(zhuǎn)座系統(tǒng)構(gòu)建了hprg1b啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)EGFP蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)品系Tg(hprg1b: EGFP)，簡(jiǎn)稱(chēng)1bEGFP。追蹤胚胎發(fā)育過(guò)程中綠色熒光信號(hào)的表達(dá)發(fā)現(xiàn)在16hpf hprg1b基因的表達(dá)信號(hào)定位于側(cè)板中胚層兩側(cè)的心臟原基中，隨后在20hpf兩側(cè)綠色熒光信號(hào)在心錐區(qū)域融合，在24hpf定位于心管的位置，48hpf后信號(hào)在心臟中檢測(cè)到。由此可見(jiàn)，hprg1b基因的時(shí)空表達(dá)譜與早期心臟的形態(tài)建成區(qū)域一致。本文

13、將1bEGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)分別與Tg(myl7:DSRED)和Tg(kdr1:MCHERRY)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)雜交后得到Tg(1bEGFP;myl7DSRED)和Tg(1bEGFP;kdrlMCHERRY)雙轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，觀察72 hpf的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)心臟發(fā)現(xiàn)Hprg1b蛋白表達(dá)只定位于心肌層。進(jìn)一步檢測(cè)75hpf的Tg(1bEGFP; myl7DSRED)雙轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)心臟發(fā)現(xiàn)hprg1b強(qiáng)表達(dá)于流出道，房室通道和流入道處。此時(shí)心臟的3D

14、立體圖像顯示hprg1b只在一部分心肌細(xì)胞細(xì)胞中表達(dá)。流氏細(xì)胞儀分析2個(gè)月大的Tg(1bEGFP; myl7DSRED)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)原代心臟細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，hprg1b陽(yáng)性細(xì)胞只占心臟細(xì)胞的10.7％，從而提示hprg1b陽(yáng)性細(xì)胞可能是一種特殊的心肌細(xì)胞。
　　本文構(gòu)建了hprg1b過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pCV/hf，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入斑馬魚(yú)干細(xì)胞系Z428中。RT-PCR初步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)hprg1b過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染1天后Z428細(xì)胞中早期心肌細(xì)胞標(biāo)記基因

15、gata4和nkx2.5，心內(nèi)膜早期標(biāo)記基因etv2和心肌細(xì)胞分化標(biāo)記基因myh6的表達(dá)均出現(xiàn)明顯的上調(diào)。進(jìn)一步用ddPCR技術(shù)精確定量這四個(gè)基因在hprg1b過(guò)表達(dá)的Z428細(xì)胞中的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)在hprg1b過(guò)表達(dá)1天后四個(gè)基因的表達(dá)與對(duì)照組相比均顯著上調(diào);2天后，nkx2.5，gata4和myh6的表達(dá)均持續(xù)增加，但etv2的表達(dá)開(kāi)始下調(diào);第三天，3個(gè)心肌細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)持續(xù)上調(diào)，但心內(nèi)膜標(biāo)記基因etv2卻持續(xù)下調(diào)。由此推斷，h

16、prg1b是通過(guò)持續(xù)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞早期標(biāo)記基因的表達(dá)，從而調(diào)控胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化進(jìn)而調(diào)控心臟發(fā)育的。
　　三、cxxc5基因在心臟發(fā)育中的功能研究
　　CXXC5(CXXC-typezinc-finger protein5)被報(bào)道在其表達(dá)的組織中發(fā)揮廣泛的生理和病理學(xué)功能。以往的研究表明CXXC5在心臟中高表達(dá)，并且CXXC5與病理性和生理性心肌重構(gòu)相關(guān)，提示CXXC5很可能在心臟發(fā)育、心肌分化和心臟疾病的發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮

17、重要作用。盡管如此，至今仍缺乏一個(gè)直接的證據(jù)闡明CXXC5在心臟中的功能。生物信息學(xué)分析表明CXXC5的功能結(jié)構(gòu)域在進(jìn)化上高度保守，因此利用斑馬魚(yú)模型探究CXXC5在早期胚胎心臟發(fā)育中的功能可為人類(lèi)早期心臟發(fā)育關(guān)鍵調(diào)控因子的篩選提供線索。
　　本文利用RT-PCR檢測(cè)cxxc5基因在斑馬魚(yú)早期胚胎中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)cxxc5在40％外包時(shí)起始表達(dá)，并持續(xù)表達(dá)于胚胎與成體斑馬魚(yú)中。原位雜交檢測(cè)cxxc5 mRNA的時(shí)空表達(dá)模式表明cxx

18、c5在40％外包時(shí)表達(dá)于卵裂球兩側(cè)邊緣生心區(qū)，在22體節(jié)時(shí)cxxc5表達(dá)于心錐，在24hpf表達(dá)于心管，在48hpf表達(dá)于心臟。cxxc5的時(shí)空表達(dá)模式提示cxxc5可能參與調(diào)控斑馬魚(yú)早期心臟發(fā)育。Morpholino敲減cxxc5的表達(dá)對(duì)心臟發(fā)育產(chǎn)生了顯著的影響。注射了cxxc5MO的胚胎約70％表現(xiàn)出環(huán)化異常，發(fā)育不良和心包水腫的表型。胚胎注射Morpholino后的致死率統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，大部分的cxxc5敲減胚胎在第七天死亡。cxxc5

19、MO與cxxc5加帽mRNA共注射可以在一定程度上拯救cxxc5MO敲減的胚胎表型，說(shuō)明cxxc5敲減胚胎的表型是由于cxxc5 mRNA表達(dá)降低造成的。原位雜交檢測(cè)心肌標(biāo)記基因cmlc2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)24hpf的cxxc5敲減胚胎中cmlc2的表達(dá)停留在中線，而并未像野生型一樣前端遷移到左眼處。48hpf的cxxc5敲減斑馬魚(yú)的心室和心房縱軸間的平均夾角為12°，與野生型的胚胎的平均夾角27°相比顯著減小。本文進(jìn)一步利用Semi-Aut

20、omated Optical Heartbeat Analysis探究了cxxc5敲減對(duì)胚胎心臟的生理學(xué)功能的影響。分析表明，cxxc5敲減后，胚胎的心動(dòng)周期顯著延長(zhǎng)，心率顯著減緩，心臟收縮面積改變率顯著減小。由此證明，cxxc5敲減后斑馬魚(yú)的心臟功能受損。
　　前期研究表明人類(lèi)CXXC5與SMADs蛋白(SMAD2，SMAD3)存在相互作用，本文通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)人類(lèi)的CXXC5，SMAD2和SMAD3與斑馬魚(yú)中的同源蛋白高

21、度同源。本實(shí)驗(yàn)室曾利用COIP和GST-pulldown證明了斑馬魚(yú)Cxxc5和Smad2，Smad3的相互作用。于是本文分別檢測(cè)了TGF-β信號(hào)熒光報(bào)告質(zhì)粒CAGA-LUC，BMP信號(hào)熒光報(bào)告質(zhì)粒BRE-LUC，和Activin信號(hào)熒光報(bào)告質(zhì)粒3TP-LUC在過(guò)表達(dá)Cxxc5的H9c2細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性，結(jié)果表明CAGA-LUC和BRE-LUC的熒光活性顯著增強(qiáng)，而3TP-LUC的活性沒(méi)有變化，由此提示cxxc5基因在心肌細(xì)胞中影響了T

22、GF-β信號(hào)和相關(guān)的BMP信號(hào)。為了找尋到TGF-β信號(hào)中Cxxc5-Smads復(fù)合物的下游靶點(diǎn)，本文分析了幾個(gè)經(jīng)典TGF-β信號(hào)下游靶基因nkx2.5，gata4，hand2和has2啟動(dòng)子區(qū)域中是否包含MH1結(jié)合結(jié)構(gòu)域SBE(Smad-binding element，CAGAC)和CpG島。結(jié)果表明gata4，hand2和has2的啟動(dòng)子中均包含Smad-binding element(CAGAC)位點(diǎn)和CpG島。RT-qPCR分析

23、表明cxxc5敲低的斑馬魚(yú)中hand2和has2的表達(dá)顯著下調(diào)。而且胚胎注射hand2加帽mRNA可有效的拯救cxxc5MO導(dǎo)致的心臟環(huán)化缺陷。從而證明cxxc5可能通過(guò)TGF-β信號(hào)的hand2調(diào)控心臟的環(huán)化過(guò)程。
　　文獻(xiàn)報(bào)道人類(lèi)CXXC5基因在先天性心臟病患兒術(shù)前和術(shù)后的表達(dá)具有顯著差異，本文利用RT-qPCR檢測(cè)了TOF病人中CXXC5的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TOF病人中CXXC5 mRNA水平顯著下調(diào)，提示CXXC5可能是TOF的臨

24、床診斷候選靶標(biāo)分子。上述結(jié)果表明，斑馬魚(yú)cxxc5是在早期心臟發(fā)育中表達(dá)的內(nèi)源性因子，可能在心臟左右不對(duì)稱(chēng)的形態(tài)建成中發(fā)揮重要作用，并且首次在體內(nèi)證明cxxc5可以通過(guò)TGF-β信號(hào)調(diào)控心臟發(fā)育與心臟環(huán)化。
　　總之，本文利用斑馬魚(yú)模型研究了tmp3，hprg1b和cxxc5基因在早期心臟發(fā)育中的功能和分子調(diào)控機(jī)制，以及其表達(dá)與人類(lèi)心臟疾病法洛氏四聯(lián)癥發(fā)生的關(guān)系，該研究豐富了有關(guān)心臟發(fā)育的分子調(diào)控理論，為先天性心臟病的臨床診斷提供