利用斑馬魚模型研究基因CXXC5在心臟發(fā)育中的作用.pdf

1、本文利用斑馬魚模型與細(xì)胞模型研究基因zCXXC5在心臟與骨骼肌發(fā)育中的作用。
　　zCXXC5基因定位于斑馬魚21號染色體上，共含有4個(gè)外顯子，跨基因組序列長達(dá)73.5kb。其mRNA長2622bp，ORF長855bp;編碼的蛋白質(zhì)含有284個(gè)氨基酸殘基，分子量為32.24 kDa。生物信息學(xué)分析表明，CXXC5蛋白含有CXXC型鋅指結(jié)構(gòu)域，在不同的物種進(jìn)化過程中是保守的。
　　我們制備了zCXXC5蛋白的抗體，免疫印跡實(shí)驗(yàn)

2、發(fā)現(xiàn)CXXC5在斑馬魚的心臟等多種組織中有高水平的表達(dá)，斑馬魚整胚原位雜交實(shí)驗(yàn)也表明CXXC5在心臟中有強(qiáng)表達(dá)。熒光亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)表明zCXXC5主要表達(dá)于細(xì)胞核中。
　　通過morpholinos反義核苷酸敲減技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)敲低zCXXC5基因的表達(dá)導(dǎo)致斑馬魚心臟不能正常環(huán)化，圍心腔有不同程度的膨大，心臟的心室明顯變小。因而心輸出量減小，嚴(yán)重影響了心臟的功能。我們采用本室建立的心臟特異表達(dá)綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(nppa:

3、gfp)作為模型進(jìn)行心臟表型和心肌細(xì)胞的數(shù)目及形態(tài)分析。心肌細(xì)胞數(shù)目的統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，心臟不能正常環(huán)化的胚胎心室中，其心肌細(xì)胞數(shù)目明顯減少，說明zCXXC5參與了發(fā)育早期心室心肌細(xì)胞的增殖調(diào)控。
　　通過免疫共沉淀的方法檢測人的SMAD蛋白家族得到與zCXXC5相互作用的蛋白hSMAD3與hSMAD2。GST-Pull down實(shí)驗(yàn)與亞細(xì)胞共定位實(shí)驗(yàn)也證明zCXXC5與hSMAD3和hSMAD2存在相互作用，進(jìn)一步用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)鑒定了

4、zCXXC5與hSMAD2和hSMAD3相互作用的作用結(jié)構(gòu)域。
　　RT-PCR實(shí)驗(yàn)分析表明，morpholino反義寡核苷酸敲低zCXXC5的表達(dá)導(dǎo)致心臟標(biāo)記Nkx2.5、Hand2、Has2、Myh6和Vmhc等表達(dá)下降，提示Nkx2.5、Hand2、Has2、Myh6和Vmhc基因很可能是CXXC5的下游基因。我們利用斑馬魚Hand2基因加帽mRNA進(jìn)行拯救實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明Hand2基因的mRNA能夠拯救morpholino反

5、義寡核苷酸敲低CXXC5表達(dá)所產(chǎn)生的異常。
　　已有報(bào)道CXXC5是視黃酸途徑的反應(yīng)因子，又與DVL相互作用參與WNT信號途徑，提示CXXC5可能通過多條信號途徑進(jìn)行調(diào)控。我們利用熒光報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)，檢測CXXC5對多種信號途徑的作用。實(shí)驗(yàn)表明CXXC5在骨骼肌分化信號途徑中也具有重要的作用。我們利用C2C12細(xì)胞系研究證明了CXXC5在骨骼肌分化形成中的作用。
　　研究表明，在C2C12成肌細(xì)胞系分化過程中CXXC5表達(dá)量增