CRELD1基因在心臟瓣膜發(fā)育過(guò)程中的作用及突變功能分析.pdf

1、研究背景
　　 先天性心臟病是常見(jiàn)的出生缺陷之一,可導(dǎo)致圍產(chǎn)期25％～35％的死亡率。心臟形成是胚胎發(fā)育的早期事件,它涉及胚胎發(fā)育過(guò)程中不同時(shí)間、不同空間若干個(gè)基因的先后表達(dá)及精確的相互作用,也涉及細(xì)胞的遷移、分化和增殖。目前認(rèn)為先天性心臟病是由于遺傳因素和環(huán)境因素共同作用于心臟發(fā)育環(huán)節(jié),導(dǎo)致一些相關(guān)基因在時(shí)間和空間上的表達(dá)異常所致。在先天性心血管畸形中,瓣膜發(fā)育異常占20-30％。
　　 心臟房室瓣的發(fā)育起源于心臟環(huán)化

2、后心管的房室溝和流出道處心內(nèi)膜墊形成。在心肌信號(hào)因子的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用下,上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化并移行至心臟膠凍層形成心內(nèi)膜墊。隨著心內(nèi)膜墊逐漸發(fā)育為成熟的瓣膜結(jié)構(gòu),瓣膜的間質(zhì)細(xì)胞趨向于增生減弱,定居在瓣膜的特定區(qū)域,分化程度高。瓣膜的細(xì)胞外基質(zhì)也趨于高度組織化。在電鏡下可見(jiàn)瓣葉的細(xì)胞外基質(zhì)分三層:纖維層、海綿層、心房層,依次沿血流方向平行排列。Tenascin是一種粘蛋白,也是腱索的“經(jīng)典"標(biāo)記物,主要在纖維層和腱束表達(dá)。Aggrecan是

3、一種蛋白聚糖,主要在海綿層表達(dá)。細(xì)胞外基質(zhì)在心臟瓣膜的有機(jī)構(gòu)成,使瓣膜各層具有不同特性,維持著心臟瓣膜在整個(gè)心動(dòng)周期的協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)和完整功能。特異性的基質(zhì)蛋白不但在瓣膜發(fā)育階段參與其重要的分層過(guò)程,而且這一作用可持續(xù)至出生后。細(xì)胞外基質(zhì)空間發(fā)育和瓣膜間質(zhì)細(xì)胞分化的不協(xié)調(diào)均可導(dǎo)致瓣膜發(fā)育異常。
　　 先天性房室間隔缺損(Atrioventricular septal defect,AVSD)是一種比較常見(jiàn)的先天性心臟病,在所有人類(lèi)已認(rèn)

4、識(shí)的先天性心臟病中占7～8％。AVSD在21-三體綜合征表現(xiàn)出密集的發(fā)病。由于該病早期即可出現(xiàn)心功能不全和不可逆的肺動(dòng)脈高壓,未經(jīng)治療的患兒大多數(shù)在5歲內(nèi)死亡。
　　 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)2個(gè)與AVSD發(fā)病有關(guān)的位點(diǎn):AVSD1和AVSD2,其中AVSD1(OMIM606215)位于染色體1p31～1921,但尚未發(fā)現(xiàn)其對(duì)應(yīng)的基因；AVSD2(OMIM606217)位于染色體3p25,對(duì)應(yīng)的基因是CRELD1(Cysteine-rich

5、 with EGF-like domain1)。CRELD1屬于表皮生長(zhǎng)因子樣家族,編碼一種細(xì)胞表面蛋白,功能上類(lèi)似細(xì)胞粘附分子。
　　 本研究對(duì)AVSD病例,進(jìn)行CRELD1基因的測(cè)序,并對(duì)突變基因進(jìn)行功能分析,以探討CRELD1基因突變?cè)贏(yíng)VSD形成中的意義。
　　 研究方法
　　 1.PCR擴(kuò)增所有AVSD病例CRELD1基因的全部11個(gè)外顯子及兩側(cè)各50個(gè)堿基以上的序列,測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與人類(lèi)CRELD1基

6、因組序列比較。
　　 2.以含CRELD1基因的pOTB7質(zhì)粒DNA序列為模板,針對(duì)CRELD1的突變序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物設(shè)計(jì)突變引物序列。
　　 3.構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1-CRELD1,轉(zhuǎn)染胚胎肺成纖維細(xì)胞HFL-Ⅰ,Western-Blot檢測(cè)CRELD1、Tenascin-C、Aggrecan蛋白表達(dá)水平,實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)CRELD1、Tenascin-C和Aggrecan mRNA表達(dá)水平。

7、
　　 研究結(jié)果
　　 1例女性患者C857G堿基變化,使位于外顯子8上第一鈣結(jié)合EGF區(qū)域286位點(diǎn)丙氨酸替代了脯氨酸?；颊呦挡糠中苑渴议g隔缺損,非21-三體綜合征。在150名正常人群中未發(fā)現(xiàn)相同位點(diǎn)的堿基變化。三維結(jié)構(gòu)重建顯示蛋白質(zhì)的空間位置發(fā)生改變。該位點(diǎn)的堿基變化遺傳自其母親,但體格檢查和超聲心動(dòng)圖檢查顯示其母親心臟結(jié)構(gòu)和功能正常。
　　 8例患者中外顯子4發(fā)現(xiàn)C383G堿基變化,該堿基變化使位于WE結(jié)構(gòu)

8、域第128位點(diǎn)的精氨酸代替脯氨酸,該堿基變化為多態(tài)性(rs2302787)。5例患者外顯子10上T1136C變化使位于Ⅲ型跨膜域379位點(diǎn)的蘇氨酸替代蛋氨酸。對(duì)150名正常人群進(jìn)行了該位點(diǎn)的檢測(cè),結(jié)果有7人存在該堿基變化,故為一新發(fā)現(xiàn)的單核苷酸多態(tài)性。15例在外顯子10發(fā)現(xiàn)一不影響氨基酸編碼的同義突變C1119T(rs3774207)。
　　 Western-blot和實(shí)時(shí)熒光定量RT-CR檢測(cè)結(jié)果顯示,CRELD1基因P286

9、A突變后,基因的功能增強(qiáng),即表現(xiàn)為“過(guò)表達(dá)”。應(yīng)用2(-△△C他)計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量,可見(jiàn)與空載對(duì)照相比,野生型和突變型Aggrecan的mRNA表達(dá)均下調(diào)(t值分別140.27,26.36,P<0.01),但突變型與野生型之間的Aggrecan表達(dá)也存在顯著差異,突變型下調(diào)更為明顯(t=-25.69,P=0.002)。Tenascin-C在野生型和空載組的表達(dá)無(wú)明顯差異(t=1.167,P>0.05),但突變型的Tenascin

10、-C表達(dá)明顯增強(qiáng)(t=6.66,P=0.022)。
　　 結(jié)論
　　 1.CRELD1基因錯(cuò)義突變是AVSD發(fā)病的高風(fēng)險(xiǎn)易感因素。但其突變率低,且突變基因攜帶者可表型正常,故AVSD可能是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的產(chǎn)物；或者是存在多個(gè)突變基因高突變率的單基因遺傳性疾病。
　　 2.CRELD1基因P286A突變可使基因功能增強(qiáng)。CRELD1過(guò)表達(dá)下調(diào)Aggrecan表達(dá)水平。CRELD1基因P286A突變下調(diào)A