膜聯蛋白A2對創(chuàng)傷性血腦屏障損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、研究背景：
　　血腦屏障主要是指單層的血管內皮細胞構成的腦毛細血管壁，其能夠選擇性地使血液中的溶質進入到腦組織中，為腦組織創(chuàng)造了一個健康的微環(huán)境，對維持中樞神經系統(tǒng)的正常生理活動有重要的作用。創(chuàng)傷性腦外傷作為血腦屏障損傷最嚴重的中樞神經系統(tǒng)疾病，已經成為世界上高致死率和致殘率的主要疾病?；颊咴谀X外傷后，血腦屏障的功能失調，使血液中大量的炎癥分子進入到腦組織，造成中樞神經系統(tǒng)的二次損傷，是創(chuàng)傷性腦外傷治療的難點所在。到目前為止，已經

2、報道過有很多分子通路參與了生理狀態(tài)下血腦屏障的功能調控，但是在中樞神經系統(tǒng)疾病狀態(tài)下參與血腦屏障功能調控的分子十分有限。
　　膜聯蛋白(Annexins)家族是鈣離子依賴的磷脂結合蛋白家族，膜聯蛋白A2(Annexin A2)作為其中的一個重要成員，在自身免疫疾病、出血綜合癥以及腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，但其在血腦屏障中的作用目前尚不清楚。近年來，有研究發(fā)現膜聯蛋白A1(Annexin A1)能夠調節(jié)血管內皮細胞的骨架

3、分布以及細胞間的緊密程度。由于Annexins家族具有高度保守的功能結構域，而膜聯蛋白A2也參與調控細胞膜的轉運活動（內吞和胞吐），故在本研究中，我們提出假設:膜聯蛋白A2是一個調控血腦屏障功能的重要分子，是一個治療因血腦屏障失調導致的中樞神經系統(tǒng)疾病潛在靶點。本研究的闡明，為篩選治療創(chuàng)傷性腦外傷潛在的分子靶點提供了理論基礎，為設計更加高效地保護血腦屏障功能失調的藥物提供了新的方向，具有重要的臨床意義，是當前迫切需要探索和解決的重要科學

4、前沿問題。
　　研究方法：
　　胚胎期血腦屏障功能測定
　　孕鼠吸入麻醉后，將胚胎暴露，臍帶仍然和母體相連，使用Hmailton注射器將5μl示蹤劑注射進入胚胎的肝臟中(4 mg/ml)，使染料通過肝臟循壞三分鐘，然后取胚胎腦組織放入4％多聚甲醛中，冷室過夜，次日放入30％蔗糖溶液中脫水。
　　成年鼠血腦屏障功能測定
　　小鼠吸入麻醉后，暴露心臟，將10-15 ml EZ連接NHS磺基生物素(0.5 mg/

5、ml)通過左心室注入，循環(huán)五分鐘后，使用磷酸鹽緩沖生理鹽水(Phosphate bufferedsaline，PBS)灌注。取出腦組織放入4％多聚甲醛中，冷室過夜，次日放入30％蔗糖溶液中脫水。
　　受控皮質沖擊手術模型
　　暴露解剖標志LAMBDA（尾椎方面）和前囟門（正面的方面）。在LAMBDA和前囪門和（1毫米遠離中線）繪制中心圓（直徑5毫米）。使用鉆孔沿標記的圓圈切割，鑷子去除骨暴露硬腦膜。致動器的速度:5米/秒;變

6、形深度:0.6毫米;調節(jié)筆尖（直徑3毫米）在平行于沖擊部位的表面的角度。
　　細胞滲透性實驗
　　將HBMEC接種于膠原蛋白鋪墊過的1.0μm遷移小室中，將小室置于24孔板中，給藥處理后，加入辣根過氧化物酶至小室的培養(yǎng)基中，終濃度為100μg/ml;60分鐘后，收集小室下面孔中的培養(yǎng)基，加入鄰甲氧基苯酚和雙氧水，至終濃度為0.5 mM（鄰甲氧基苯酚），0.6 mM（雙氧水）。顯色后，在吸收波長為490 nm的酶標儀中測量從小

7、室中滲漏出的辣根過氧化物酶的量。
　　研究結果：
　　1.膜聯蛋白A2在血腦屏障功能形成和成熟中的重要作用
　　在野生型小鼠和A2-/-小鼠胚胎期13.5天，10 kDa的示蹤劑已經聚集于野生型小鼠的腦血管中，沒有滲漏現象。在A2-/-小鼠皮層位置，卻觀察到該示蹤劑有滲漏現象。在A2-/-小鼠胚胎期15.5天，10 kDa示蹤劑也聚集于腦血管中，表明隨著發(fā)育，A2-/-小鼠的血腦屏障功能也在完善。值得注意的是，在A2-

8、/-小鼠胚胎期15.5天，550 Da小分子示蹤劑仍然存在滲漏，野生型小鼠卻沒有滲漏。在出生后4天以及成年12周的野生型小鼠和A2-/-小鼠的腦組織中，也觀察到了同樣的現象。以上的實驗結果均提示膜聯蛋白A2參與血腦屏障功能形成和成熟，并且膜聯蛋白A2的缺失會導致血腦屏障對小分子的滲漏增加。
　　提取三個月大的野生型小鼠和A2-/-小鼠的腦徽血管內皮細胞，分析連接復合體的表達水平。結果表明，與野生型小鼠比較，緊密連接蛋白:ZO-1、

9、Claudin-5、粘附連接蛋白VE-cadherin的表達在A2-/-小鼠腦徽血管中明顯降低。以上實驗證明膜聯蛋白A2的缺失會造成血腦屏障的功能失調。
　　2.膜聯蛋白A2對創(chuàng)傷性血腦屏障損傷的保護作用
　　受控皮質沖擊手術(Controlled cordical impact models，CCI)后24小時，通過尾靜脈注射10 kDa的熒光示蹤劑可以發(fā)現A2-/-小鼠血管滲漏的程度高于野生型小鼠。在埃文斯藍測定血腦屏障

10、功能的實驗中，也得到了相似的結果。隨后提取腦血管內皮細胞，對連接復合體的表達進行了檢測，發(fā)現相對于野生型小鼠，A2-/-小鼠中緊密連接蛋白:ZO-1、Occludin、Claudin-5、粘附連接蛋白:VE-cadherin的表達均明顯降低。以上實驗均表明膜聯蛋白A2的缺失造成了腦外傷對血腦屏障更嚴重的損傷。CCI手術后2小時，尾靜脈注射不同劑量的重組膜聯蛋白A2(Recombinant annexin A2，rA2)，結果顯示相對于牛

11、血清白蛋白(Albumin frombovine serum，BSA)對照組，給予rA2（0.75 mg/kg-1.5 mg/kg）能有效地降低血管的滲漏。更重要的是，即使在CCI手術后6小時給予rA2（1 mg/kg）也能有效地降低血管的滲漏。同時，CCI手術后1小時給予rA2（1 mg/kg）的治療能有效地增加緊密連接蛋白:ZO-1和粘附連接蛋白:VE-cadherin的表達。以上均證明了重組膜聯蛋白A2能夠有效的逆轉腦外傷造成的血

12、腦屏障功能失調，并且增加連接復合體的蛋白表達水平。
　　在體外試驗中，使用小干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）將人腦微血管內皮細胞（Human brain microvascular endothelial cell，HBMEC）中膜聯蛋白A2表達沉默，我們發(fā)現細胞間的滲透性顯著高于對照組。在單層緊密的HBMEC中加入炎癥分子白介素-1β(Interlukin1β，IL-1β)，細胞的滲透性顯著增

13、加，而rA2可以逆轉這種損傷。進一步，創(chuàng)傷性腦外傷在體外模擬模型:IL-1β+缺氧混合模型能明顯增加HBMEC的滲透性，而rA2也能逆轉這種損傷。提取HBMEC的細胞膜蛋白，并對連接復合體的表達進行了檢測。IL-1β+缺氧能降低所有連接復合體蛋白的表達，而給予rA2后，能顯著增加ZO-1和VE-cadherin在細胞膜上的表達。以上實驗表明，rA2通過影響ZO-1和VE-cadherin的表達以及在細胞中的分布來保護IL-1β+缺氧造成

14、的血管內皮細胞滲透增加。
　　3.膜聯蛋白A2對創(chuàng)傷性血腦屏障損傷的保護作用機制
　　提取人腦微血管內皮細胞的膜蛋白，使用膜聯蛋白A2的特異性單克隆抗體進行免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）。結果顯示膜聯蛋白A2能夠和細胞膜上粘附連接蛋白VE-cadherin以及細胞骨架蛋白F-actin相互結合。IL-1β+缺氧能夠減少膜聯蛋白A2在HBMEC胞膜上的分布，而給予rA2后，細胞膜上膜聯蛋

15、白A2的量明顯增加。這也導致膜聯蛋白A2和VE-cadherin、F-actin的相互作用增加，進而穩(wěn)定VE-cadhefin和F-actin在腦血管內皮細胞膜上的分布，增加細胞的緊密連接性。
　　IL-1β+缺氧明顯激活了小G蛋白酶ARF6，而rA2能夠抑制ARF6的激活。利用siRNA沉默內源性膜聯蛋白A2的表達，細胞內的ARF6被明顯激活。使用ARF6的特異性激活劑QS11能降低連接復合體的表達水平，而rA2能夠逆轉ZO-1

16、和 VE-cadherin的減少。使用ARF6的特異性抑制劑SecinH3，能夠抑制IL-1β+缺氧造成的ZO-1和VE-cadherin在細胞膜上表達的降低，而rA2的作用并沒有強于SecinH3+rA2組保護作用。以上實驗表明:rA2調控血腦屏障連接復合體的表達主要依賴于ARF6通路。
　　研究結論：
　　膜聯蛋白A2參與血腦屏障功能的形成和成熟，膜聯蛋白A2的缺失使胚胎期血腦屏障出現損傷，并且該損傷能伴隨至成年。在生理

17、情況造成小分子的滲漏，也會加重創(chuàng)傷性腦外傷導致的血腦屏障損傷。外源給予重組的膜聯蛋白A2能夠保護創(chuàng)傷性腦外傷造成的血腦屏障滲漏，避免二次損傷的發(fā)生。膜聯蛋白A2能通過和腦血管內皮細胞膜上的粘附連接蛋白VE-cadherin、細胞骨架蛋白F-actin相互作用，穩(wěn)定它們在膜上的分布。同時，外源性給予重組膜聯蛋白A2能抑制ARF6分子的活化從而增加連接復合體在膜上的表達，增加腦血管內皮細胞間的緊密連接性。該研究不僅拓展了膜聯蛋白A2的功能以