組蛋白去乙?；敢种苿?duì)創(chuàng)傷性腦損傷小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分組蛋白去乙酰化酶抑制劑Scriptaid對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用
　　創(chuàng)傷性腦損傷(traumaitc brain injury，TBI)是神經(jīng)外科領(lǐng)域常見的急癥之一，目前已成為全世界35歲以下青壯年人群第一位死亡和致殘?jiān)?。但是目前臨床上尚無(wú)一種確切的藥物對(duì)腦損傷肯定有效。最新研究發(fā)現(xiàn)，在TBI后組蛋白乙?；斤@著降低，并且可能與繼發(fā)性損傷如氧化應(yīng)激和興奮性毒性相關(guān)。使用某些組蛋白去乙?；?HDAC)抑制劑能

2、明顯改善TBI后運(yùn)動(dòng)功能，增強(qiáng)神經(jīng)可塑性和學(xué)習(xí)記憶能力，減輕腦組織損傷，這提示HDAC抑制劑對(duì)于TBI可能是一種非常有潛力多效神經(jīng)保護(hù)劑。Scriptaid是異羥肟酸類中較新型的HDAC抑制劑，副作用較小，安全系數(shù)較高，目前國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有將Scriptaid運(yùn)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的報(bào)道。因此，十分有必要將Scriptaid對(duì)于TBI損傷后的神經(jīng)保護(hù)作用作全面評(píng)估，同時(shí)對(duì)于其可能涉及細(xì)部、分子機(jī)制作深入研究。
　　我們首先建立標(biāo)準(zhǔn)化的

3、小鼠控制性皮層撞擊模型(controlled cortical impact，CCI)實(shí)現(xiàn)可重復(fù)性的創(chuàng)傷性腦損傷，來(lái)模擬人類腦外傷情況。手術(shù)后0.5或12小時(shí)分別給予1.5、3.5、5.5 mg/Kg Scriptaid腹腔注射。采用肌力測(cè)試、前肢不對(duì)稱測(cè)試以及錯(cuò)步實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)測(cè)小鼠短期和長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)功能。TBI后29至34天利用水迷宮測(cè)試認(rèn)知功能。焦油紫染色用來(lái)分析計(jì)算腦損傷體積和計(jì)算海馬CA3區(qū)存活神經(jīng)元數(shù)量。微管相關(guān)蛋白-2(MAP-2)

4、組織化學(xué)染色結(jié)合Fluo-Jade B染色來(lái)分析創(chuàng)傷后神經(jīng)元退行性變。同時(shí)為了探討Scriptaid神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，我們利用免疫組化和Western bolt方法來(lái)研究相關(guān)信號(hào)通路激活情況。
　　研究結(jié)果顯示，Scriptaid對(duì)于創(chuàng)傷性腦損傷小鼠具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用，且存在著劑量依賴關(guān)系（尤以3.5μg/g劑量療效最佳），即使TBI后12小時(shí)給予治療仍然有效;TBI后損傷周邊區(qū)HDAC1、HDAC2、HDAC3具有不同程度增加，

5、使用Scriptaid后能明顯抑制HDAC活性，增強(qiáng)乙酰化H3、H4水平。Scriptaid治療對(duì)于TBI后小鼠具有長(zhǎng)期的神經(jīng)保護(hù)作用，能明顯改善神經(jīng)功能評(píng)分，提高學(xué)習(xí)、記憶能力，減少海馬CA3區(qū)神經(jīng)元丟失，阻止神經(jīng)元退行性變。免疫熒光和Western blot結(jié)果顯示p-AKT和p-PTEN于TBI后在損傷側(cè)皮層和海馬CA3區(qū)顯著下降，而總AKT和PTEN水平并沒(méi)有發(fā)生變化。使用Scriptaid治療后能使p-PTNE水平增加，進(jìn)而增

6、強(qiáng)PTEN的穩(wěn)定性而使其活性下降，從而減少對(duì)于AKT通路的負(fù)性調(diào)控作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，S嘶ptaid能通過(guò)增加PTEN磷酸化激酶ROCK1 mRNA表達(dá)來(lái)調(diào)控PTEN的磷酸化。最后，使用AKT通路的抑制劑LY294002后，能逆轉(zhuǎn)Scriptaid的神經(jīng)保護(hù)作用，進(jìn)一步反向證明Scriptaid通過(guò)激活PTEN/AKT通路來(lái)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
　　總之，本研究發(fā)現(xiàn)HDAC抑制劑Scriptaid能顯著減輕TBI造成的急、慢性損害

7、，改善神經(jīng)功能，減少TBI后腦組織缺失，同時(shí)能明顯減輕海馬神經(jīng)元變性壞死，增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶功能，其作用與激活PTEN/PI3K/AKT通路有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)為臨床運(yùn)用Scriptadi治療TBI，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第二部分抑制組蛋白去乙?；缚烧{(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞極化動(dòng)態(tài)并參與TBI白質(zhì)損傷修復(fù)
　　創(chuàng)傷性顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）不僅導(dǎo)致腦灰質(zhì)損傷，同時(shí)可產(chǎn)生嚴(yán)重的白質(zhì)損傷

8、。研究發(fā)現(xiàn)在TBI病人白質(zhì)損傷的程度與長(zhǎng)期的運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能缺陷有相關(guān)性。因此，為何在臨床前實(shí)驗(yàn)中，神經(jīng)保護(hù)劑如果只是單一強(qiáng)調(diào)對(duì)灰質(zhì)的保護(hù)，一旦過(guò)度到臨床試驗(yàn)時(shí)通常都會(huì)失敗。本研究發(fā)現(xiàn)新型HDAC抑制劑Scriptaid能增強(qiáng)組蛋白乙?；?，并對(duì)TBI具有強(qiáng)烈的神經(jīng)保護(hù)作用，但是其對(duì)于TBI白質(zhì)損傷的演變和預(yù)后依然未知，很值得再深入研究。
　　首先通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化的控制性皮層撞擊來(lái)建立可重復(fù)性的小鼠腦外傷模型。運(yùn)用RT-PCR的方法測(cè)定腦組

9、織內(nèi)M1期和M2期不同的標(biāo)記物分子mRNA水平時(shí)間依從性的表達(dá)情況;采用免疫熒光染色、共聚焦成像等方法觀察TBI后皮層、紋狀體、胼胝體等不同腦區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞激活的時(shí)間依從性。髓鞘相關(guān)蛋白(MBP)和非磷酸化神經(jīng)絲重鏈(SMI-32)免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)來(lái)檢測(cè)TBI白質(zhì)損傷情況，并與小膠質(zhì)細(xì)胞極化動(dòng)態(tài)做相關(guān)性分析。使用HDAC抑制劑Scirptaid于TBI后6小時(shí)給予3.5 mg/Kg腹腔注射，小鼠于不同時(shí)間點(diǎn)處死，最長(zhǎng)觀察直至術(shù)后35天。體

10、外實(shí)驗(yàn)中，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子釋放。采用條件性培養(yǎng)基交換系統(tǒng)來(lái)分析HDAC抑制對(duì)于小膠質(zhì)細(xì)胞的極化作用以及不同亞型小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)于損傷后少突膠質(zhì)細(xì)胞的影響。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TBI后小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)時(shí)間依從性的極化現(xiàn)象，即經(jīng)歷了短暫性M2型之后轉(zhuǎn)化為更持久的M1型。同時(shí)TBI后存在時(shí)間依從性白質(zhì)損傷，伴有M1小膠質(zhì)細(xì)胞增加，M2型減少，而且前者與白質(zhì)損傷程度呈現(xiàn)正相關(guān);體外實(shí)驗(yàn)也表明，M1型小膠質(zhì)細(xì)胞能加劇少突膠質(zhì)細(xì)胞

11、死亡，而M2型則能發(fā)揮保護(hù)作用。Scriptaid后能明顯抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，并能調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)變。重要的是，Scriptaid通過(guò)介導(dǎo)對(duì)于小膠質(zhì)細(xì)胞亞型的調(diào)控作用來(lái)發(fā)揮對(duì)于TBI白質(zhì)損傷的保護(hù)作用，具有維持白質(zhì)的正常結(jié)構(gòu)形態(tài)，保持髓鞘的完整性的功能。
　　綜述所述，機(jī)械性腦外傷可以誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的急、慢性的炎癥反應(yīng)。小膠質(zhì)細(xì)胞由短暫的M2亞型很快被慢性的M1亞型所取代，且后者與白質(zhì)損傷的嚴(yán)重程度