膜聯(lián)蛋白Annexin1對(duì)大鼠腦出血后血腦屏障損傷保護(hù)作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分、膜聯(lián)蛋白Annexin1與腦出血的相關(guān)性研究
　　目的：研究大鼠腦出血（ICH）后血清、腦組織中以及體外ICH模型中膜聯(lián)蛋白Annexin1(ANXA1)在ICH后不同時(shí)間點(diǎn)的變化。
　　方法：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分，隨機(jī)任選42只大鼠分為假手術(shù)組和ICH后6h、12h、24h、48h、72h、1w共7組，每組6只。所有的大鼠在腦出血后相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)被處死。在每組大鼠取血腫周圍1.5-2mm范圍內(nèi)腦組織，利用雙重免疫熒光和We

2、stern blot技術(shù)分析檢測(cè)其ANXA1的表達(dá)，尾靜脈采血提取血清，利用酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測(cè)ANXA1水平。在體外實(shí)驗(yàn)中取人類腦血管內(nèi)皮（hCMEC/D3）細(xì)胞依據(jù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分分為7組，利用western blot檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞中ANXA1的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠腦出血后腦組織中ANXA1表達(dá)下降，以ICH后24h組ANXA1表達(dá)下降最顯著（P<0.01）；
　　2、大鼠血清的ANXA1表

3、達(dá)在ICH后呈先下降后恢復(fù)的趨勢(shì)，在24hANXA1分泌值達(dá)最低（P<0.05）；
　　3、體外血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果ANXA1蛋白表達(dá)先下降后恢復(fù)，18h下降最明顯（P<0.01）；
　　4、血清中ANXA1下降水平較腦組織及血管內(nèi)皮細(xì)胞慢，恢復(fù)也相對(duì)遲緩。
　　結(jié)論：
　　1、ICH后血管內(nèi)皮細(xì)胞ANXA1表達(dá)呈先下降后恢復(fù)，在腦組織及血清中 ANXA1水平在腦出血24h后達(dá)最低；
　　2、在體外實(shí)驗(yàn)中人

4、類腦血管內(nèi)皮（hCMEC/D3）細(xì)胞ANXA1表達(dá)與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似；
　　3、血清中ANXA1的水平，在ICH后下降及恢復(fù)速度相對(duì)腦組織遲緩。
　　第二部分、人重組ANXA1在腦出血后血腦屏障損傷誘發(fā)早期腦損傷中的保護(hù)作用
　　目的：探索大鼠尾靜脈注射人重組ANXA1對(duì)大鼠腦出血預(yù)后及血腦屏障保護(hù)作用。
　　方法：在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，任選120只，隨機(jī)分為假手術(shù)組（sham）、腦出血+溶劑組（ICH+vehicle）

5、、腦出血+人重組ANXA1低劑量組（ICH+ANXA1-L）、腦出血+人重組 ANXA1中劑量組（ICH+ANXA1-M）、腦出血+人重組ANXA1高劑量組（ICH+ANXA1-H），共計(jì)5組（n=24/組）。在基底節(jié)注射膠原酶3小時(shí)后尾靜脈注射rhANXA1，腦出血后24小時(shí)，所有大鼠放血。每組取6只大鼠腦做切片進(jìn)行TUNEL染色、Fluoro-Jade B（FJB）染色；每組取6只大鼠腦組織進(jìn)行Western Blot分析和免疫共沉

6、淀分析；另外每組取6只大鼠用于伊文思藍(lán)染色檢測(cè)血腦屏障的破壞，而剩下每組6只大鼠每進(jìn)行腦水腫的評(píng)估。
　　結(jié)果：
　　1、TUNEL染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果，腦出血組較假手術(shù)組凋亡指數(shù)明顯增高。rhANXA1中高劑量治療組血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡明顯改善（P＜0.01）；
　　2、FJB染色陽性細(xì)胞在腦出血組較假手術(shù)組明顯增多，rhANXA1中高劑量干預(yù)后FJB陽性細(xì)胞明顯下降（P＜0.01）；
　　3、高劑量組對(duì)誘導(dǎo)閉合蛋白和閉鎖

7、小帶-1（ZO-1）蛋白水平上調(diào)有重要作用（P＜0.01）；
　　4、rhANXA1在腦出血后干預(yù)，血管中外滲到腦組織的伊文思藍(lán)染料明顯減少（P＜0.01）。中高劑量的rhANXA1能夠改善ICH后白蛋白的外滲（P＜0.05）。最后，腦水含量在高劑量組明顯比低劑量組腦水含量低（P＜0.01）。
　　結(jié)論：通過提高腦出血后ANXA1的水平，能夠改善腦出血預(yù)后和維護(hù)血腦屏障的完整性。
　　第三部分、膜聯(lián)蛋白Annexin1

8、對(duì)大鼠腦出血后血腦屏障損傷保護(hù)作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：通過小干擾RNA和定點(diǎn)突變技術(shù)研究ANXA1潛在的保護(hù)作用機(jī)制。
　　方法：
　　1、通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)來分析ANXA1與β-肌動(dòng)蛋白/FPR2受體之間作用在假手術(shù)組和ICH治療組中的不同。
　　2、使用免疫共沉淀方法，通過檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞野生型和突變體的ANXA1磷酸化情況。
　　3、篩選干擾效果最佳的siRNA進(jìn)行干擾ANXA1的表達(dá)，檢測(cè)干擾

9、后或點(diǎn)突變后的內(nèi)皮細(xì)胞滲透性。
　　4、利用免疫熒光的方法檢測(cè)F-肌動(dòng)蛋白與ANXA1的分布關(guān)系，在氧合血紅蛋白作用下的變化。
　　5、通過免疫共沉淀的方法驗(yàn)證ANXA1與FPR2相互作用關(guān)系，以及對(duì)ANXA1的分泌影響。
　　結(jié)果：
　　1、ICH誘導(dǎo)ANXA1磷酸化，尤其在絲氨酸-27和蘇氨酸-24；
　　2、ANXA1對(duì)腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性作用依賴磷酸化；
　　3、ANXA1蘇氨酸-24殘