環(huán)境友好型防腐劑ε-聚賴氨酸生物合成工藝的研究.pdf

1、ε-聚賴氨酸(ε-poly-Lysine，ε-PL)是由25～35個(gè)L-賴氨酸殘基通過(guò)α-COOH和ε-NH2脫水縮合形成的，分子量約為3500～4500 Da，其具有安全性高、抑菌譜廣、適用pH范圍寬等特點(diǎn)。ε-PL主要作為食品防腐劑使用，也應(yīng)用在生物材料和藥物載體領(lǐng)域。ε-PL在日本早已形成了工業(yè)化生產(chǎn)，而我國(guó)這方面的研究起步較晚。因此，選育ε-PL高產(chǎn)菌株并優(yōu)化發(fā)酵工藝以提高ε-PL發(fā)酵水平，對(duì)我國(guó)實(shí)現(xiàn)ε-PL工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支

2、撐具有重要意義。
　　本論文以白色鏈霉菌（Streptomyces albulus）FQ-23作為出發(fā)菌株，采用硫酸二乙酯(DES)誘變結(jié)合抗性篩選，并優(yōu)化誘變菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基;通過(guò)利用搖瓶補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)，探究ε-PL合成的最佳補(bǔ)料成分，并測(cè)定其關(guān)鍵酶活性;在菌體生長(zhǎng)階段，利用5L發(fā)酵罐探究了最佳的pH調(diào)控工藝，同時(shí)考察了流加不同有機(jī)氮源ε-PL產(chǎn)量之間的差異，具體研究?jī)?nèi)容如下:
　　(1)通過(guò)DES化學(xué)誘變并結(jié)合甘氨酸(Gly)

3、、L-賴氨酸(L-Lys)、磺胺胍(SG)抗性篩選，得到一株誘變菌株FQF-3，ε-PL產(chǎn)量為0.976g/L，與出發(fā)菌株相比，其產(chǎn)量提高了8.93％。
　　(2)通過(guò)對(duì)有機(jī)氮源的篩選，選擇玉米漿和魚(yú)粉作為ε-PL發(fā)酵的混合有機(jī)氮源，利用單因素實(shí)驗(yàn)，確定了碳氮源的最佳濃度。利用Central Composite中心組合設(shè)計(jì)(CCD)，通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化其發(fā)酵培養(yǎng)基，得出優(yōu)化模型:Y=1.370-0.006A-0.004B-0.010C

4、+0.027D-0.006AB+0.005AC-0.004AD+0.010BC+0.009BD-0.007CD-0.083A2-0.087B2-0.081 C2-0.110D2，優(yōu)化后的培養(yǎng)基為(g/L):葡萄糖49.70，(NH4)2SO49.95，玉米漿7.79，魚(yú)粉12.52，KH2PO4·12H2O1.36，MgSO4·7H2O0.5，K2HPO4·3H2O0.8，F(xiàn)eSO4·7H2O0.03，ZnSO4·7H2O0.04，此時(shí)

5、ε-PL產(chǎn)量最大值為1.373g/L，比優(yōu)化之前提高了40.7％。
　　(3)通過(guò)搖瓶補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)，研究了補(bǔ)料成分不同對(duì)ε-PL合成的影響，同時(shí)補(bǔ)葡萄糖及硫酸銨與酵母粉混合液的效果最好，ε-PL最高產(chǎn)量達(dá)1.75 g/L。在此基礎(chǔ)之上，把有機(jī)氮源變成魚(yú)粉產(chǎn)量有所提高，ε-PL最高產(chǎn)量為1.89 g/L。為了改善補(bǔ)魚(yú)粉在菌體濃度方面的不足，采用玉米漿與魚(yú)粉復(fù)配，結(jié)果顯示，玉米漿與魚(yú)粉的濃度比為1∶2時(shí)，ε-PL最高產(chǎn)量為2.13 g/L

6、，在補(bǔ)魚(yú)粉的基礎(chǔ)上提高了13％。測(cè)定了補(bǔ)有機(jī)氮源后天冬氨酸激酶(ASK)及ε-合成酶(Pls)的活性，補(bǔ)混合有機(jī)氮源和補(bǔ)魚(yú)粉的ASK酶活性相當(dāng)，都比補(bǔ)酵母粉的高;補(bǔ)混合有機(jī)氮源的Pls活性在補(bǔ)這幾種有機(jī)氮源中時(shí)最高的，分別是補(bǔ)酵母粉的2.7倍和補(bǔ)魚(yú)粉的1.2倍，驗(yàn)證了補(bǔ)混合有機(jī)氮源的效果是最好的。
　　(4)研究了在菌體生長(zhǎng)階段，當(dāng)初始pH6.8分別自然下降到6.5、6.0、5.5、5.0時(shí)，用12.5％的氨水溶液維持12h，最終

7、確定pH維持在5.0最有利于菌體的生長(zhǎng)及ε-PL的累積。在此基礎(chǔ)上，研究了當(dāng)初始pH下降到5.0時(shí)，分別用氨水維持6h、12h、18h，結(jié)果證實(shí)了pH5.0維持12h的效果最好，ε-PL最高產(chǎn)量為2.81g/L，最高菌體濃度為16.96g/L。
　　(5)基于上述pH調(diào)控下，在間歇流加葡萄糖的同時(shí)，分別間歇流加硫酸銨與酵母粉、魚(yú)粉、玉米漿、牛肉膏4種不同有機(jī)氮源的混合液，流加魚(yú)粉的產(chǎn)量最高，達(dá)29.30g/L，與酵母粉相比，產(chǎn)量提