microRNA-182-5p在三氯乙烯肝毒性中的作用機制.pdf

1、目的：
　　以三氯乙烯染毒 B6C3F1雄性小鼠，篩選肝臟內(nèi)差異表達的 microRNA，在小鼠永生化肝細胞系BNL CL.2、小鼠肝癌細胞系Hepa1-6和人肝癌細胞系HepG2中進一步分析所篩選的miR-182-5p的 DNA甲基化調(diào)控機制及其在三氯乙烯引起的細胞增殖中的作用，目的是了解三氯乙烯肝毒性的毒作用機制，為評估三氯乙烯對人肝臟的危害及其臨床防治提供科學依據(jù)。
　　方法：
　　體內(nèi)實驗：將7周齡B6C3F1

2、雄性小鼠隨機分成4組，每組5只，以不同劑量三氯乙烯（0，100，500，1000 mg/kg b.w.）染毒5天，利用基因芯片篩選肝臟內(nèi)差異表達的microRNA；以熒光定量PCR驗證microRNA的表達，以熒光定量PCR和Western Blot檢測預測靶基因mRNA和蛋白表達水平；以重亞硫酸鹽測序方法檢測microRNA啟動子區(qū)DNA甲基化水平。
　　細胞實驗：用不同濃度三氯乙烯染毒處于對數(shù)生長期的BNL CL.2、Hepa

3、1-6和HepG2細胞48小時，用MTT和平板克隆方法檢測細胞增殖率和存活率；以流式細胞儀分析細胞周期及細胞凋亡；以堿性彗星實驗檢測對 DNA損傷的影響；以miR-182-5p抑制物和類似物轉(zhuǎn)染BNL CL.2和Hepa1-6細胞，用MTT和EdU標記實驗檢測對三氯乙烯染毒細胞的增殖影響；以甲基化酶抑制劑5-aza-2’-dC和組蛋白乙?；敢种苿?TSA處理細胞，檢測對 miR-182-5p表達的影響；用熒光定量PCR和Western

4、 Blot檢測預測靶基因的mRNA和蛋白表達。
　　結(jié)果：
　?。?）1000mg/kg b.w.三氯乙烯染毒5天的小鼠肝臟中有8個miRNA表達上調(diào)，1個miRNA表達下降，其中miR-182-5p上調(diào)表達最為顯著，并與三氯乙烯濃度有劑量關系；同時三氯乙烯可引起miR-182-5p基因啟動子區(qū)低甲基化；三氯乙烯還導致miR-182-5p預測靶基因Dnmt3a、Dnmt3b和Cited2等的mRNA表達水平下降，其中Cite

5、d2的mRNA和蛋白表達均降低。
　?。?）與對照相比，非細胞毒性劑量（0.1和/或0.3mM）的三氯乙烯染毒48h后可引起B(yǎng)NL CL.2、Hepa1-6和HepG2細胞不同程度的增殖加快；平板克隆實驗發(fā)現(xiàn)可使這三種細胞系的克隆形成率升高，存活率增加；流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)BNL CL.2和Hepa1-6細胞G1期阻滯減??；但對這三種細胞系不引起顯著的細胞凋亡和DNA損傷。
　?。?）在小鼠BNL CL.2、Hepa1-6和人

6、HepG2細胞中，0.1和0.3mM三氯乙烯濃度下可引起miR-182-5p表達增加，并引起B(yǎng)NL CL.2細胞內(nèi)預測靶基因Dnmt3a、Dnmt3b和Cited2等的 mRNA表達水平下降，其中Cited2的蛋白表達水平也降低；miR-182-5p抑制物可逆轉(zhuǎn)三氯乙烯引起的細胞增殖；5-aza-2’-dC處理可引起miR-182-5p表達增加。
　　結(jié)論：
　　三氯乙烯可能通過抑制肝臟中Dnmt3a和Dnmt3b等DNA甲