microRNA-182-5p在三氯乙烯肝毒性中的作用機(jī)制.pdf

1、目的：
　　以三氯乙烯染毒 B6C3F1雄性小鼠，篩選肝臟內(nèi)差異表達(dá)的 microRNA，在小鼠永生化肝細(xì)胞系BNL CL.2、小鼠肝癌細(xì)胞系Hepa1-6和人肝癌細(xì)胞系HepG2中進(jìn)一步分析所篩選的miR-182-5p的 DNA甲基化調(diào)控機(jī)制及其在三氯乙烯引起的細(xì)胞增殖中的作用，目的是了解三氯乙烯肝毒性的毒作用機(jī)制，為評(píng)估三氯乙烯對(duì)人肝臟的危害及其臨床防治提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：將7周齡B6C3F1

2、雄性小鼠隨機(jī)分成4組，每組5只，以不同劑量三氯乙烯（0，100，500，1000 mg/kg b.w.）染毒5天，利用基因芯片篩選肝臟內(nèi)差異表達(dá)的microRNA；以熒光定量PCR驗(yàn)證microRNA的表達(dá)，以熒光定量PCR和Western Blot檢測(cè)預(yù)測(cè)靶基因mRNA和蛋白表達(dá)水平；以重亞硫酸鹽測(cè)序方法檢測(cè)microRNA啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平。
　　細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：用不同濃度三氯乙烯染毒處于對(duì)數(shù)生長期的BNL CL.2、Hepa

3、1-6和HepG2細(xì)胞48小時(shí)，用MTT和平板克隆方法檢測(cè)細(xì)胞增殖率和存活率；以流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡；以堿性彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì) DNA損傷的影響；以miR-182-5p抑制物和類似物轉(zhuǎn)染BNL CL.2和Hepa1-6細(xì)胞，用MTT和EdU標(biāo)記實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)三氯乙烯染毒細(xì)胞的增殖影響；以甲基化酶抑制劑5-aza-2’-dC和組蛋白乙?；敢种苿?TSA處理細(xì)胞，檢測(cè)對(duì) miR-182-5p表達(dá)的影響；用熒光定量PCR和Western

4、 Blot檢測(cè)預(yù)測(cè)靶基因的mRNA和蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　?。?）1000mg/kg b.w.三氯乙烯染毒5天的小鼠肝臟中有8個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，1個(gè)miRNA表達(dá)下降，其中miR-182-5p上調(diào)表達(dá)最為顯著，并與三氯乙烯濃度有劑量關(guān)系；同時(shí)三氯乙烯可引起miR-182-5p基因啟動(dòng)子區(qū)低甲基化；三氯乙烯還導(dǎo)致miR-182-5p預(yù)測(cè)靶基因Dnmt3a、Dnmt3b和Cited2等的mRNA表達(dá)水平下降，其中Cite

5、d2的mRNA和蛋白表達(dá)均降低。
　　（2）與對(duì)照相比，非細(xì)胞毒性劑量（0.1和/或0.3mM）的三氯乙烯染毒48h后可引起B(yǎng)NL CL.2、Hepa1-6和HepG2細(xì)胞不同程度的增殖加快；平板克隆實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可使這三種細(xì)胞系的克隆形成率升高，存活率增加；流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BNL CL.2和Hepa1-6細(xì)胞G1期阻滯減??；但對(duì)這三種細(xì)胞系不引起顯著的細(xì)胞凋亡和DNA損傷。
　?。?）在小鼠BNL CL.2、Hepa1-6和人

6、HepG2細(xì)胞中，0.1和0.3mM三氯乙烯濃度下可引起miR-182-5p表達(dá)增加，并引起B(yǎng)NL CL.2細(xì)胞內(nèi)預(yù)測(cè)靶基因Dnmt3a、Dnmt3b和Cited2等的 mRNA表達(dá)水平下降，其中Cited2的蛋白表達(dá)水平也降低；miR-182-5p抑制物可逆轉(zhuǎn)三氯乙烯引起的細(xì)胞增殖；5-aza-2’-dC處理可引起miR-182-5p表達(dá)增加。
　　結(jié)論：
　　三氯乙烯可能通過抑制肝臟中Dnmt3a和Dnmt3b等DNA甲