血漿激肽釋放酶激肽系統(tǒng)在三氯乙烯致敏小鼠腎臟損傷中的作用研究.pdf

1、背景：
　　三氯乙烯（Trichloroethylene，TCE）是一種具有揮發(fā)性的有機溶劑。由于其高效的去污能力，被廣泛的用于工業(yè)中金屬、線路板等物質的清洗。近年來，由于TCE大規(guī)模的生產和應用，已成為一種普遍存在的環(huán)境污染物，長期暴露的工人還可導致職業(yè)性TCE藥疹樣皮炎(ODMLT)。大量的臨床病例顯示，腎臟損傷最后導致的腎衰竭是許多患者死亡的原因之一，故腎臟損傷越來越受到研究者的重視。有研究發(fā)現血漿激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(Pl

2、asma kallikrein-kinin system，KKS)與機體的炎癥損傷和免疫系統(tǒng)有密切關系。本課題組前期研究發(fā)現 TCE致敏小鼠的腎臟中不僅有炎癥性損傷，免疫性損傷也參與其中。故本研究探討KKS在TCE致敏小鼠的免疫性腎損傷機制中的作用。
　　目的：
　　參考豚鼠最大值實驗以及本課題組前期的研究報道建立TCE致敏的BALB/c小鼠模型。通過腹腔注射血漿激肽釋放酶的特異性抑制劑PKSI以及檢測KKS中的主要成分BK

3、、PK、B1R、B2R以及 C5b-9的表達以探討KKS在TCE致敏小鼠體內的活化情況以及其在免疫性腎損傷中的作用。
　　方法：
　　選購6～8W，體重20-25g的健康雌性BALB/c小鼠。經過一周的適應性飼養(yǎng)后，小鼠被隨機分成4組，分別是：空白對照組、溶劑對照組、TCE處理組以及PKSI處理組。參考豚鼠最大值實驗以及本課題組前期的研究報道建立BALB/c小鼠致敏模型，并在兩次激發(fā)前24h腹腔注射PKSI。根據小鼠背部受試

4、部位的致敏情況以及處死的時間不同將其分為TCE致敏24h、48h、72h和7d組、TCE未致敏24h、48h、72h和7d組、PKSI致敏24h、48h、72h和7d組和PKSI未致敏24h、48h、72h和7d組。采用ELISA法檢測血漿中BK的表達水平。免疫熒光法檢測腎臟組織中的BK、PK、B1R和B2R的沉積情況。qRT-PCR法檢測腎臟組織中B1R和B2R mRNA表達水平。Western blot法檢測腎臟組織中B1R和B2R

5、蛋白表達水平。免疫組化法檢測C5b-9在腎臟組織中的沉積情況。
　　結果：
　　1.致敏率
　　本研究中的空白對照組和溶劑對照組均未見到紅腫現象；TCE處理組共有120只小鼠，其中有48只小鼠背部皮膚有明顯的紅腫，故致敏率為40％，致敏強度為中度；PKSI處理組也有120只小鼠，其中僅27只小鼠背部皮膚有明顯的紅腫，故致敏率為22.5%，致敏強度為輕度；本研究中，總的致敏率為31.25%。
　　2.腎臟病理檢查結

6、果
　　通過腎臟組織的 HE染色結果，發(fā)現TCE致敏組的腎臟中有大量的炎細胞浸潤以及腎小管上皮細胞空泡樣變性，而相應時點的PKSI致敏組的腎臟，損傷明顯減輕。其余組未見明顯異常。
　　3.腎功能檢測結果
　　腎功能檢查主要對血清中BUN和Cr這兩個具有代表性的指標進行檢測。結果發(fā)現，空白對照組與溶劑對照組的BUN和Cr相比，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與溶劑對照組相比，TCE致敏組的24h、48h和72h組的B

7、UN和Cr表達明顯增高且差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；其中，TCE致敏組的48h和72h組的BUN表達明顯高于相應時點的TCE未致敏組以及 PKSI致敏組（P<0.05）。TCE致敏組的24h、48h和72h組Cr的表達明顯高于相應時點的未致敏組，且其72h組的表達與相應時點的PKSI致敏組相比，表達明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　4.血漿中BK的表達水平
　　結果顯示：空白對照組與溶劑對照組相比較，差

8、異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與溶劑對照組相比，TCE致敏組的四個時點以及PKSI致敏組的24h和48h組的BK表達水平明顯增加，且差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。TCE致敏組的24h、48h和72h組與相應的未致敏組相比，BK表達水平同樣顯著增加，且差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。PKSI致敏組的72h組與相應時點的TCE致敏組相比，BK表達水平明顯下降，且差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　5.腎臟組織中BK、PK、

9、B1R和B2R的沉積情況
　　結果顯示如下：腎臟組織中BK、PK、B1R和B2R沉積的變化趨勢大致相似：在空白對照組與溶劑對照組中的沉積都比較少，甚至沒有；而在TCE致敏組中四個指標的沉積量隨著時點的變化逐漸增加，并在72h時點達到最高峰，在7d時有所恢復；PKSI致敏組的四個時點的四個指標都較TCE致敏組的相應時點的沉積量相對降低。
　　6.腎臟組織中B1R和B2R mRNA表達情況
　　采用qRT-PCR法檢測腎臟

10、組織中B1R和B2R mRNA的表達水平。結果如下：空白對照組與溶劑對照組相比，兩個指標的差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。TCE致敏組的四個時點以及PKSI致敏組的24h和48h組的B1R mRNA表達水平與溶劑對照組相比較明顯增加，且差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。TCE致敏組的B2R mRNA表達水平也是逐漸增加的，且在72h時點達到最高。PKSI致敏組的B1R以及B2R mRNA表達水平都較TCE致敏組的相應時點相對降低。在

11、72h時點組，TCE致敏組比PKSI致敏組的B1R和B2R mRNA表達水平顯著增加，且差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　7.腎臟組織中B1R和B2R的蛋白表達水平
　　采用Western blot法檢測腎臟組織中B1R以及B2R的蛋白表達水平。結果顯示：空白對照組與溶劑對照組的B1R蛋白幾乎不表達，B2R的表達也比較少。TCE致敏組的B1R和B2R的表達明顯比溶劑對照組增加，且差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。兩個受

12、體在TCE致敏組中的表達也明顯比PKSI致敏組多，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　8.腎臟組織中C5b-9的沉積情況
　　結果顯示如下：在空白對照組與溶劑對照組中C5b-9的表達都比較少，且差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；在TCE致敏組中24h、48h、72h沉積量逐漸增加，并在72h組達到最高峰，與溶劑對照組相比顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），在7d時有所降低； PKSI致敏組的四個時點的C5b-9表