血漿激肽釋放酶激肽系統(tǒng)在三氯乙烯致敏小鼠腎臟損傷中的作用研究.pdf

1、背景：
　　三氯乙烯（Trichloroethylene，TCE）是一種具有揮發(fā)性的有機(jī)溶劑。由于其高效的去污能力，被廣泛的用于工業(yè)中金屬、線路板等物質(zhì)的清洗。近年來，由于TCE大規(guī)模的生產(chǎn)和應(yīng)用，已成為一種普遍存在的環(huán)境污染物，長期暴露的工人還可導(dǎo)致職業(yè)性TCE藥疹樣皮炎(ODMLT)。大量的臨床病例顯示，腎臟損傷最后導(dǎo)致的腎衰竭是許多患者死亡的原因之一，故腎臟損傷越來越受到研究者的重視。有研究發(fā)現(xiàn)血漿激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(Pl

2、asma kallikrein-kinin system，KKS)與機(jī)體的炎癥損傷和免疫系統(tǒng)有密切關(guān)系。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn) TCE致敏小鼠的腎臟中不僅有炎癥性損傷，免疫性損傷也參與其中。故本研究探討KKS在TCE致敏小鼠的免疫性腎損傷機(jī)制中的作用。
　　目的：
　　參考豚鼠最大值實(shí)驗(yàn)以及本課題組前期的研究報(bào)道建立TCE致敏的BALB/c小鼠模型。通過腹腔注射血漿激肽釋放酶的特異性抑制劑PKSI以及檢測KKS中的主要成分BK

3、、PK、B1R、B2R以及 C5b-9的表達(dá)以探討KKS在TCE致敏小鼠體內(nèi)的活化情況以及其在免疫性腎損傷中的作用。
　　方法：
　　選購6～8W，體重20-25g的健康雌性BALB/c小鼠。經(jīng)過一周的適應(yīng)性飼養(yǎng)后，小鼠被隨機(jī)分成4組，分別是：空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、TCE處理組以及PKSI處理組。參考豚鼠最大值實(shí)驗(yàn)以及本課題組前期的研究報(bào)道建立BALB/c小鼠致敏模型，并在兩次激發(fā)前24h腹腔注射PKSI。根據(jù)小鼠背部受試

4、部位的致敏情況以及處死的時(shí)間不同將其分為TCE致敏24h、48h、72h和7d組、TCE未致敏24h、48h、72h和7d組、PKSI致敏24h、48h、72h和7d組和PKSI未致敏24h、48h、72h和7d組。采用ELISA法檢測血漿中BK的表達(dá)水平。免疫熒光法檢測腎臟組織中的BK、PK、B1R和B2R的沉積情況。qRT-PCR法檢測腎臟組織中B1R和B2R mRNA表達(dá)水平。Western blot法檢測腎臟組織中B1R和B2R

5、蛋白表達(dá)水平。免疫組化法檢測C5b-9在腎臟組織中的沉積情況。
　　結(jié)果：
　　1.致敏率
　　本研究中的空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組均未見到紅腫現(xiàn)象；TCE處理組共有120只小鼠，其中有48只小鼠背部皮膚有明顯的紅腫，故致敏率為40％，致敏強(qiáng)度為中度；PKSI處理組也有120只小鼠，其中僅27只小鼠背部皮膚有明顯的紅腫，故致敏率為22.5%，致敏強(qiáng)度為輕度；本研究中，總的致敏率為31.25%。
　　2.腎臟病理檢查結(jié)

6、果
　　通過腎臟組織的 HE染色結(jié)果，發(fā)現(xiàn)TCE致敏組的腎臟中有大量的炎細(xì)胞浸潤以及腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變性，而相應(yīng)時(shí)點(diǎn)的PKSI致敏組的腎臟，損傷明顯減輕。其余組未見明顯異常。
　　3.腎功能檢測結(jié)果
　　腎功能檢查主要對(duì)血清中BUN和Cr這兩個(gè)具有代表性的指標(biāo)進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組與溶劑對(duì)照組的BUN和Cr相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與溶劑對(duì)照組相比，TCE致敏組的24h、48h和72h組的B

7、UN和Cr表達(dá)明顯增高且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；其中，TCE致敏組的48h和72h組的BUN表達(dá)明顯高于相應(yīng)時(shí)點(diǎn)的TCE未致敏組以及 PKSI致敏組（P<0.05）。TCE致敏組的24h、48h和72h組Cr的表達(dá)明顯高于相應(yīng)時(shí)點(diǎn)的未致敏組，且其72h組的表達(dá)與相應(yīng)時(shí)點(diǎn)的PKSI致敏組相比，表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　4.血漿中BK的表達(dá)水平
　　結(jié)果顯示：空白對(duì)照組與溶劑對(duì)照組相比較，差

8、異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與溶劑對(duì)照組相比，TCE致敏組的四個(gè)時(shí)點(diǎn)以及PKSI致敏組的24h和48h組的BK表達(dá)水平明顯增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。TCE致敏組的24h、48h和72h組與相應(yīng)的未致敏組相比，BK表達(dá)水平同樣顯著增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。PKSI致敏組的72h組與相應(yīng)時(shí)點(diǎn)的TCE致敏組相比，BK表達(dá)水平明顯下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　5.腎臟組織中BK、PK、

9、B1R和B2R的沉積情況
　　結(jié)果顯示如下：腎臟組織中BK、PK、B1R和B2R沉積的變化趨勢大致相似：在空白對(duì)照組與溶劑對(duì)照組中的沉積都比較少，甚至沒有；而在TCE致敏組中四個(gè)指標(biāo)的沉積量隨著時(shí)點(diǎn)的變化逐漸增加，并在72h時(shí)點(diǎn)達(dá)到最高峰，在7d時(shí)有所恢復(fù)；PKSI致敏組的四個(gè)時(shí)點(diǎn)的四個(gè)指標(biāo)都較TCE致敏組的相應(yīng)時(shí)點(diǎn)的沉積量相對(duì)降低。
　　6.腎臟組織中B1R和B2R mRNA表達(dá)情況
　　采用qRT-PCR法檢測腎臟

10、組織中B1R和B2R mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果如下：空白對(duì)照組與溶劑對(duì)照組相比，兩個(gè)指標(biāo)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。TCE致敏組的四個(gè)時(shí)點(diǎn)以及PKSI致敏組的24h和48h組的B1R mRNA表達(dá)水平與溶劑對(duì)照組相比較明顯增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。TCE致敏組的B2R mRNA表達(dá)水平也是逐漸增加的，且在72h時(shí)點(diǎn)達(dá)到最高。PKSI致敏組的B1R以及B2R mRNA表達(dá)水平都較TCE致敏組的相應(yīng)時(shí)點(diǎn)相對(duì)降低。在

11、72h時(shí)點(diǎn)組，TCE致敏組比PKSI致敏組的B1R和B2R mRNA表達(dá)水平顯著增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　7.腎臟組織中B1R和B2R的蛋白表達(dá)水平
　　采用Western blot法檢測腎臟組織中B1R以及B2R的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示：空白對(duì)照組與溶劑對(duì)照組的B1R蛋白幾乎不表達(dá)，B2R的表達(dá)也比較少。TCE致敏組的B1R和B2R的表達(dá)明顯比溶劑對(duì)照組增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。兩個(gè)受

12、體在TCE致敏組中的表達(dá)也明顯比PKSI致敏組多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　8.腎臟組織中C5b-9的沉積情況
　　結(jié)果顯示如下：在空白對(duì)照組與溶劑對(duì)照組中C5b-9的表達(dá)都比較少，且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；在TCE致敏組中24h、48h、72h沉積量逐漸增加，并在72h組達(dá)到最高峰，與溶劑對(duì)照組相比顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），在7d時(shí)有所降低； PKSI致敏組的四個(gè)時(shí)點(diǎn)的C5b-9表