六味地黃丸對糖尿病大鼠肝臟的保護作用及其機制研究.pdf

1、背景:
　　 糖尿病是一種嚴重危害人類健康的慢性代謝性疾病。國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)估計,到2025年全球?qū)⒂谐^3億3000萬的人患糖尿病。截止2003年,中國已成為糖尿病第二大國,僅次于印度,中國成為了全球糖尿病增長最快的國家之一。最新的流行病學調(diào)查數(shù)據(jù)顯示,我國20歲以上的成人糖尿病患病率達9.7％,其中男性10.6％,女性8.8％,而糖尿病前期患病率更達15.5％。據(jù)此推算,我國有9240萬成年人患糖尿病,1.482億成

2、年人處于糖尿病前期,糖尿病已成為我國乃至全球人類共同的威脅。2002年我國糖尿病醫(yī)療費158.2億人民幣,約占衛(wèi)生事業(yè)費4％,平均普通糖尿病病人3726元/年/人(占19％),有并發(fā)癥病人13897元/年/人(占81％),糖尿病的早期診斷,防治糖尿病慢性并發(fā)癥對減輕患者負擔尤為重要。
　　 糖尿病慢性并發(fā)癥是導致糖尿病患者致死致殘的主要原因,不僅累及心腦血管、腎臟、視網(wǎng)膜、神經(jīng)等重要臟器和組織,肝臟也是其重要的靶器官之一。隨著糖

3、尿病病程的延長,發(fā)生肝臟病變的危險性及其病變程度也隨之增加。糖尿病性肝損傷是指糖尿病引起的肝臟組織學和功能變化,是糖尿病的一種慢性并發(fā)癥。糖尿病性肝損傷主要表現(xiàn)為非酒精性脂肪肝病變(NAFLD),迄今為止對糖尿病并發(fā)NAFLD的發(fā)病機制還了解甚少。一方面,可能胰島素抵抗作勾原發(fā)病因參與NAFLD的發(fā)生和發(fā)展；另一方面,肝臟脂性改變以及肝細胞員傷可加劇胰島素抵抗,進而促進代謝綜合征及其相關(guān)病變的發(fā)生。
　　 然而由于肝臟本身代償功

4、能較強,以及早期的肝臟損害常常不明顯等原因,糖尿病性肝損傷常被人們忽視,當肝損害進展至后期如肝硬化時,病情往往己不可逆轉(zhuǎn)。因此,必須重視糖尿病性肝損傷,并給予有效的早期干預(yù)措施,以保護糖尿病患者的肝臟功能,減少不可逆性肝損害的發(fā)生。
　　 肝臟作為胰島素作用的主要靶器官,是人體糖及脂肪代謝的重要器官。糖尿病時脂肪分解增加,游離脂肪酸(free fatty acids,FFA)產(chǎn)生過多并在肝臟內(nèi)積聚,對肝臟造成脂毒性損害。同時,過

5、多的FFA又可通過諸如刺激糖異生等多種途徑在胰島素靶細胞內(nèi)造成胰島素抵抗,加重糖代謝紊亂。因此,控制脂質(zhì)代謝紊亂、減輕肝臟胰島素抵抗不僅是治療糖尿病性肝損傷的有效途徑,也是治療糖尿病的新途徑之一。對胰島素抵抗和糖尿病動物模型的研究發(fā)現(xiàn),肝細胞PEPCK活性及基因表達增高。磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)是抑制糖原異生的關(guān)鍵酶,其活性改變對肝臟葡萄糖代謝紊亂具有重要影響。在脂肪肝形成過程中,肝臟從頭合成脂質(zhì)的相關(guān)酶,如脂肪酸合酶(fa

6、tty acid synthase,FAS)和乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase,ACC)的代謝活躍。ACC是糖代謝與脂代謝的共同調(diào)控點,是二者的聯(lián)系樞紐。ACC有2種亞型,ACC1和ACC2,在肝臟中均有分布。這兩個亞型由不同的基因編碼,具有不同組織分布和生物學效應(yīng)。Takai等研究表明ACCmRNA水平的調(diào)控具有組織特異性,在肝臟中ACCmRNA的表達水平最高。有研究發(fā)現(xiàn)長期高脂飲食導致肝臟細胞脂肪酸從頭

7、合成ACC1基因表達增加,促進脂肪的從頭合成。ACC基因表達增加進一步加劇了肝臟中TG的積累,增加了肝臟的胰島素抵抗。Abu-Elheiga等用基因剔除的方法來研究ACC2基因缺失的小鼠。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),由于ACC2基因的缺失,小鼠體內(nèi)低含量的丙二酰輔酶A導致了脂肪酸氧化速率的增加、肝臟中脂肪堆積的減少以及肝臟中糖原的減少、FFA水平降低。這些觀察支持ACC在糖尿病的脂代謝中擔任了重要角色。
　　 固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBPs

8、)是調(diào)控脂肪酸、膽固醇和甘油三酯合成酶的重要轉(zhuǎn)錄因子,激活SREBPs和肝臟X受體(liver X receptor,LXR)基因的轉(zhuǎn)錄表達,可以調(diào)控脂代謝關(guān)鍵酶的基因轉(zhuǎn)錄。SREBPs根據(jù)其結(jié)構(gòu)及特征分為SREBP-1和SREBP-2,SREBP-1是一類位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的膜連接蛋白,屬于螺旋-環(huán).螺旋.亮氨酸鋅指(BHLH-Zip)轉(zhuǎn)錄因子家族,其合成產(chǎn)物為結(jié)合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的無活性前體,約為1150個氨基酸,當細胞內(nèi)脂肪水平低時,SREBP

9、-1前體裂解,釋放出活性片段,促進脂肪合成相關(guān)酶的基因表達,增加細胞內(nèi)脂肪合成。目前研究清楚的證實,SREBP-1在瘦素缺乏的肥胖小鼠(Lepob/ob)的脂肪肝的發(fā)展中起關(guān)鍵性的作用。SREBP-1通過調(diào)節(jié)脂肪生成酶的表達水平控制肝臟中甘油三酯的積累。在胰島素抵抗的成因中,中性脂肪的合成是由許多酶參與的,主要酶幾乎都是在基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)下起作用,這個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)擔當因子之一就是SREBP-1。胰島素抵抗引起的高胰島素血癥通過上調(diào)SREB

10、P-1表達,促使脂肪酸從頭合成增加,從而使肝臟生成FFA增多。SREBP-1又分SREBP-1a,SREBP-1c,兩者是從同一基因的兩個不同的啟始部位轉(zhuǎn)錄。SREBP-1c與SREBP-1a比較是一個弱的轉(zhuǎn)錄活性劑,并且是肝臟和脂肪組織中主要的獨立形式。SREBP*1c在調(diào)節(jié)脂肪酸合成上比膽固醇合成具有更重要的作用,被認為是一個在脂肪細胞中表達的脂肪細胞分化決定因子1(ADD1)。對2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝的動物模型研究發(fā)現(xiàn),肝臟

11、SREBP-1c mRNA表達明顯高于正常對照組。Kakuma等的研究發(fā)現(xiàn)SREBP-1c過度表達可引起FAS基因轉(zhuǎn)錄增加,引起脂肪酸合成增多和TG增加,在肝臟等非脂肪組織異常沉積,形成脂肪肝。Nogalska等發(fā)現(xiàn),在大鼠脂肪組織中,隨著瘦素水平升高,ACC表達逐漸降低,與抑制ACC上游調(diào)控因子SREBP-1c表達有關(guān)。綜上所述,PEPCK、SREBPs和CCA三者與糖脂代謝的調(diào)控密切相關(guān),而糖脂代謝紊亂又是糖尿病性肝損傷的基礎(chǔ),因此

12、推測三者在糖尿病性肝損傷的發(fā)病機制中可能具有一定作用。
　　 胰島素受體后信號通路缺陷是2型糖尿病患者胰島素抵抗的重要機制,胰島素和胰島素受體結(jié)合后通過胰島素受體底物(IRS)等一系列代謝信號,最終調(diào)節(jié)糖、脂肪和蛋白質(zhì)等的代謝。IRS屬于細胞質(zhì)中的接頭蛋白(adaptor),是胰島素敏感組織中的一組與各種胰島素生物效應(yīng)調(diào)節(jié)關(guān)系極為密切的信號蛋白,主要連接胰島素受體和多種效應(yīng)分子。目前已發(fā)現(xiàn)至少有9種胰島素受體底物(IRS-1,I

13、RS-2,IRS-3,IRS-4,Gab-1,SHc和他的3個異構(gòu)體以及p62dok),前4種作為IRS蛋白家族的主要成員,和Insulin/IGF信號轉(zhuǎn)導關(guān)系密切,其中以IRS-1、IRS-2的研究最多。正常情況下,IRS-1在胰島素信號轉(zhuǎn)導中起主要的作用,但當IRS-1受抑制時,IRS-2成為胰島素受體的主要底物,但IRS-2需要更高濃度的胰島素才能與p85結(jié)合而傳導胰島素信號。二者比較,在胰島素代謝效應(yīng)方面,促進肌肉、脂肪組織攝取

14、利用葡萄糖,以IRS-1為主；而促進肝臟糖原合成和抑制肝葡萄糖輸出,以IRS-2為主；而同時作為調(diào)節(jié)β細胞功能的重要信號分子,IRS-1主要調(diào)節(jié)胰島素分泌過程,IRS-2則主要調(diào)節(jié)β細胞增殖、生長、存活。隨著基因剔除技術(shù)的發(fā)展,發(fā)現(xiàn)剔除IRS-1基因的純合子動物(IRS-1-/-)只發(fā)生胰島素抵抗而不導致糖尿病。在剔除IRS-2基因的純合子動物(IRS-2-/-)中,具有全部2型糖尿病特征。
　　 近年來的研究顯示,非特異性炎癥

15、因子干擾胰島素信號轉(zhuǎn)導通路是導致胰島素抵抗的重要分子機制。IKK/NFκB信號轉(zhuǎn)導通路包括NFκB、NFκB抑制蛋白(Inhibitor kappaB,IκB)和IκB激酶(IκB Kinase,IKK)。NFκB廣泛存在于體內(nèi)細胞,是一種重要的前炎癥基因的核轉(zhuǎn)錄因子,參與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細胞凋亡及物質(zhì)代謝等多種生物進程,是炎癥啟動、調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子,在肝組織的炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、肝細胞凋亡和再生中發(fā)揮著重要作用。IKK(Inhibi

16、torkappaB Kinase)是調(diào)節(jié)炎癥過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子NFκB的激活物,是炎癥IKK/NFκB信號通路干擾胰島素信號轉(zhuǎn)導的樞紐。NFκB與其抑制物IκB在細胞漿中分離,進而轉(zhuǎn)位至細胞核內(nèi),一方面進一步促進炎癥因子的分泌和表達,另一方面可以干擾胰島素信號轉(zhuǎn)導途徑,引起胰島素抵抗。因此,本課題以糖脂代謝調(diào)控的關(guān)鍵靶點、胰島素受體后信號通路及炎癥信號通路為切入點,旨在探討糖尿病性肝損害的分子機制。
　　 六味地黃方為滋陰補腎的

17、經(jīng)典名方,對機體具有廣泛作用,不但具有調(diào)節(jié)糖代謝和免疫功能、對抗多種損傷、穩(wěn)定細胞膜等作用,而且具有價格低廉且毒副作用小的優(yōu)點。近年大量研究發(fā)現(xiàn),六味地黃丸可通過保護胰島功能及改善胰島素抵抗而減低2型糖尿病的發(fā)生率。但目前關(guān)于六味地黃丸對糖尿病性肝損傷的作用及其機制研究尚未見報道。
　　 本研究以自發(fā)性2型糖尿病大鼠模型OLETF鼠及其同系正常鼠LETO鼠為研究對象,通過給予祖國傳統(tǒng)中藥六味地黃丸進行干預(yù),檢測模型中脂代謝相關(guān)指

18、標及肝臟形態(tài)學改變,初步探討六味地黃丸對肝臟的保護作用；然后對肝臟中糖脂代謝關(guān)鍵因子以及胰島素受體后信號通路/炎癥信號通路進行研究,嘗試從分子水平闡明六味地黃丸對糖尿病性肝損傷可能的保護機制,為臨床糖尿病性肝損傷的防治提供實驗依據(jù)。
　　 第一部分六味地黃丸對OLETF鼠肝臟脂代謝的影響
　　 目的：
　　 了解六味地黃丸對自發(fā)性2型糖尿病大鼠模型OLETF鼠的糖脂代謝紊亂及肝臟形態(tài)學的影響。
　　 方法

19、：
　　 1、OLETF鼠隨機分為2組,分別為蒸餾水對照組和六味地黃丸預(yù)防組,每組各20只。同系非糖尿病LETO鼠為正常對照組。
　　 2、分別于13、18、23、30、34和40周齡以剪尾法采血測定血糖值,行口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)。
　　 3、分別于8、32和40周齡隨機處死大鼠,采集血標本；取脂肪組織；分離大鼠肝臟組織,置于液氮中保存?zhèn)溆谩?br>　　 4、計算內(nèi)臟脂肪重量,并比較各組體脂比。

20、>　　 5、檢測空腹血清葡萄糖、血漿胰島素水平、甘油三酯、膽固醇、游離脂肪酸。
　　 6、大鼠肝臟組織制備石蠟切片及冰凍切片,HE染色和MASSON染色觀察大鼠肝臟組織學形態(tài)的改變,明確肝臟病變性質(zhì)。
　　 結(jié)果：
　　 1、對照組和干預(yù)組負荷后2h血糖(2hPG)分別于23和30周齡時出現(xiàn)明顯升高,分別為10.1±1.8mmol/L和9.4±2.3mmol/L。在40周齡時,對照組和干預(yù)組的葡萄糖曲線下面積(

21、AUC)均顯著高于LETO組(P<0.05),但干預(yù)組顯著低于對照組(P<0.01)。
　　 2、對照組和干預(yù)組分別在23和40周齡始發(fā)生糖尿病,發(fā)病率隨周齡延長而升高,40周齡時發(fā)病率分別為92.9％和28.6％(P<0.01)；LETO組無糖尿病或糖耐量減低(IGT)的發(fā)生。
　　 3、與LETO組相比,對照組除空腹血糖升高不顯著外,大鼠體重、脂肪含量、體脂比、空腹血漿胰島素、血清甘油三酯、膽固醇、游離脂肪酸均顯著升

22、高,胰島素敏感指數(shù)顯著降低。干預(yù)組與對照組相比,空腹血糖無明顯變化,但空腹胰島素和血清甘油三酯、膽固醇、血清游離脂肪酸均顯著降低(P<0.05),胰島素敏感指數(shù)顯著增高。
　　 4、8周齡時,各組大鼠肝臟結(jié)構(gòu)無明顯差別。32周齡時,對照組及干預(yù)組大鼠肝細胞均出現(xiàn)明顯空泡樣變性,40周齡時,對照組肝細胞空泡樣變性更加明顯,可見肝索排列紊亂；干預(yù)組的肝臟病變較32周齡時改善,仍見小部分肝細胞空泡樣變性,肝小葉結(jié)構(gòu)基本存在,有輕度肝細

23、胞脂肪變性。MASSON染色提示40周齡對照組大鼠肝臟膠原纖維增生不明顯,LETO組及干預(yù)組肝臟均未見膠原增生。
　　 結(jié)論：
　　 1、六味地黃丸可顯著降低OLETF鼠2型糖尿病的發(fā)病率,有效預(yù)防糖尿病的發(fā)生。并能夠顯著降低OLETF鼠血糖升高程度,延緩高血糖的出現(xiàn)。
　　 2、六味地黃丸能有效減少OLETF鼠內(nèi)臟脂肪堆積,并顯著降低血清甘油三酯、膽固醇、血清游離脂肪酸和血漿胰島素水平。
　　 3、六味

24、地黃丸有助于改善肝細胞脂肪變性,維持OLETF鼠肝臟的正常結(jié)構(gòu)。
　　 第二部分六味地黃丸對OLETF鼠肝臟保護作用的機制
　　 目的：
　　 了解自發(fā)性2型糖尿病模型OLETF鼠糖脂代謝調(diào)控相關(guān)基因(PEPCK、SREBP-1、ACC)、炎癥因子(NFκB、IKK)和胰島素受體底物(IRS-1、IRS-2)在肝臟的表達變化及其相關(guān)性,探討六味地黃丸干預(yù)對OLETF鼠肝臟保護作用的相關(guān)機制。
　　 方法：

25、
　　 1、熒光定量RT-PCR檢測PEPCK、SREBP-1、ACC在各組大鼠肝臟組織中的表達情況,并用圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。
　　 2、免疫印跡法(western blot)檢測p-IRS-1、p-IRS-2和IKK在各組大鼠肝臟組織中的蛋白表達情況,并用圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。
　　 3、免疫組化法檢測NFκB在各組大鼠肝臟的表達情況,用圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。
　　 4、分析IKK、NFκB、p-IR

26、S-1、p-IRS-2、PEPCK、SREBP-1、ACC基因表達的相關(guān)性。
　　 5、實驗數(shù)據(jù)計量資料以均數(shù)±標準差((x)±s)。采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計。同一樣本不同周齡組間均數(shù)的比較采用配伍組設(shè)計的方差分析(ANOVA)檢驗,LSD法進行兩兩比較。各指標間的相關(guān)分析采用pearson相關(guān)分析。均以α=0.05為標準。
　　 結(jié)果：
　　 1、六味地黃丸對各組大鼠肝臟中PEPCKmRNA表達的影響:

27、各周齡LETO組的PEPCK表達均顯著低于同周齡的對照組及干預(yù)組。40周齡時干預(yù)組大鼠PEPCK表達顯著低于對照組。
　　 2、六味地黃丸對各組大鼠肝臟中SREBP-1mRNA表達的影響:LETO組隨周齡增加SREBP表達穩(wěn)定,而對照組和干預(yù)組均隨周齡而增加(P<0.01)。同周齡LETO組SREBP表達顯著低于對照組和干預(yù)組(P<0.01),并且干預(yù)組顯著低于對照組(p<0.01)。
　　 3、六味地黃丸對各組大鼠肝臟

28、中ACCmRNA表達的影響:各周齡對照組ACC表達均顯著高于LETO組及干預(yù)組,且對照組ACC表達隨周齡增加而明顯增加(P<0.01)。
　　 4、六味地黃丸對各組大鼠肝臟中p-IRS-1和p-IRS-2蛋白表達的影響:各組p-IRS-1和p-IRS-2表達隨大鼠周齡增加呈下降趨勢。對照組p—IRS-1和p-IRS-2表達在各周齡段均顯著低LETO組(P<0.05)及干預(yù)組(P<0.05)。
　　 5、六味地黃丸對各組大

29、鼠肝臟中NFκB表達的影響:各組NFκB表達均隨周齡而增加,其中對照組增加幅度最大。各周齡對照組NFκB表達均顯著高于LETO組(P<0.01)和干預(yù)組(P<0.05)。
　　 6、六味地黃丸對各組大鼠肝臟中IKK蛋白表達的影響:LETO組IKK表達隨周齡增加無明顯變化；對照組及干預(yù)組IKK表達均隨周齡而增加,且各周齡間存在顯著差異(P<0.01)。各周齡LETO組IKK表達均顯著低于對照組和干預(yù)組(P<0.01),而其中干預(yù)組

30、又顯著低于對照組(P<0.01)。
　　 7、IKK、NFκB分別與PEPCK(rIKK=0.701,P<0.01；rNFκB=0.756,P<0.01)、SREBP—1(rIKK=0.925,P<0.01；rNFκB=-0.870,P<0.01)、ACC(rIKK=-0.850,P<0.01；rNFκB=-0.832,P<0.01)的表達呈高度正相關(guān)；與p—IRS-1(rIKK=-0.703,P<0.01；rNFκB=-0.7

31、50,P<0.01)、p-IRS-2(rIKK=-0.505,P<0.01；rNFκB=-0.561,P<0.01)呈負相關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1、六味地黃丸能降低OLETF鼠肝臟中PEPCKmRNA、SREBPmRNA和ACCmRNA的表達,可能通過抑制糖異生、減少脂質(zhì)合成,從而改善肝臟的糖脂代謝紊亂。
　　 2、六味地黃丸可能通過提高肝臟IRS-1和IRS-2表達改善胰島素抵抗。
　　 3、六味地