重組桿狀病毒介導甲型H1N1流感基因工程疫苗研究.pdf

1、流感是一種急性的經(jīng)呼吸道傳染的疾病，無論是對動物養(yǎng)殖業(yè)還是人類健康均造成嚴重的危害。2009年4月，墨西哥、美國等國家相繼爆發(fā)了豬源甲型H1N1流感的疫情，之后迅速蔓延至全球范圍內(nèi)的許多國家和地區(qū)。同年6月，世界衛(wèi)生組織將此次流感流行的預警級別提升至6級。針對如此大的疫情，疫苗接種是預防和控制流感流行最有效的方法，流感病毒滅活疫苗是目前用于預防流感最為廣泛的疫苗。盡管滅活疫苗保護率較好，但仍存在著不足，如制備周期較長、需要大量雞胚，另外

2、少數(shù)個體在疫苗接種后會產(chǎn)生不良反應。因此，科研工作者一直在試圖研制一種更安全、更高效的流感疫苗。
　　 桿狀病毒一直被用于在昆蟲細胞中表達外源蛋白。最近的研究報道，表明桿狀病毒載體在真核生物啟動子的驅動下可以轉導不同類型的哺乳動物細胞并表達外源基因，同樣基因在不同啟動子的控制下，其表達水平也會有很大的差異，且經(jīng)水泡性口膜炎病毒G蛋白(VSV/G)修飾的桿狀病毒，其宿主范圍更廣，在哺乳動物細胞中的轉導效率更高。
　　 鑒于

3、此，本研究對甲型H1N1流感基因工程疫苗進行新的探索，構建了兩種啟動子驅動甲型H1N1流感免疫原性蛋白表達的重組桿狀病毒疫苗，并在小鼠模型上對所構建的疫苗進行免疫效力評價，主要研究內(nèi)容如下：
　　 1、重組桿狀病毒BV-CMV-HA/M1/NA和BV-ie1-HA/M1/NA的構建
　　 利用對蝦白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus，WSSV)的ie1啟動子和人巨細胞病毒的CMV啟動子分別構

4、建了囊膜表面展示有VSV-G蛋白重組桿狀病毒，兩種啟動子驅動的重組桿狀病毒都介導甲型H1N1流感新型基因工程疫苗BV-CMV-HA/M1/NA和BV-ie1-HA/M1/NA。
　　 2、多克隆抗體的制備和重組桿狀病毒BV-CMV-HA/M1/NA、BV-ie1-HA/M1/NA的體外表達分析
　　 在HA序列的基礎上，設計引物擴增HA的亞基(tHA1)，用基因工程方法，構建原核表達質(zhì)粒pET28a-tHA1，將原核表達

5、質(zhì)粒pET28a-tHA1轉化大腸桿菌BL21(DE3)細胞，通過IPTG誘導獲得了以包涵體形式表達的重組蛋白。將重組蛋白tHA1進行SDS-PAGE電泳，將目的蛋白從蛋白膠上割下，稱量，用研缽研磨至糊狀后在小鼠背部多點皮下注射，注射劑量為200uL。間隔兩周，再次同上方法注射，后每周加強免疫一次，并每周采血檢測抗體，至抗體符合要求時，即對小鼠進行眼眶采血大量收集血清，即為鼠源多克隆抗體。
　　 為證實重組桿狀病毒在體內(nèi)能否有效

6、表達外源蛋白，將重組桿狀病毒BV-CMV-HA/M1/NA和BV-ie1-HA/Ml/NA轉導BHK-21細胞，IFA試驗表明，重組桿狀病毒BV-CMV-HA/M1/NA和BV-ie1-HA/M1/NA均能夠在體外表達外源蛋白。
　　 3、重組桿狀病毒BV-CMV-HA/M1/NA和BV-ie1-HA/M1/NA在小鼠體內(nèi)誘導的免疫原性評價
　　 為探討重組桿狀病毒疫苗的免疫效果，以1×109PFU/只的劑量免疫BLAB

7、/c小鼠，同時用甲型H1N1流感病毒滅活疫苗做對照。結果表明：在細胞免疫方面，兩種重組桿狀病毒均產(chǎn)生了較好的體液免疫水平，另外滅活疫苗也產(chǎn)生了較好的體液免疫水平。在細胞免疫方面，檢測了IFNγ的轉錄和蛋白表達水平，實驗結果表明，重組桿狀病毒疫苗誘導了較好的細胞免疫，滅活疫苗誘導的細胞免疫水平相對于重組桿狀病毒疫苗組則較低。
　　 4、鼠肺適應甲型H1N1流感病毒株的制備和重組桿狀病毒BV-CMV-HA/M1/NA、BV-ie1-