紅曲霉丙酮酸脫羧酶基因克隆表達及酶學性質分析.pdf

1、目的：丙酮酸脫羧酶(Pyruvate decarboxylase, PDC, E.C.4.1.1.1)是丙酮酸代謝的關鍵酶，它也能催化芳香族氨基酸前體生物轉化成光活性α-羥基酮。本研究構建紅曲霉cDNA文庫，篩選得到丙酮酸脫羧酶PDC基因，原核表達pdc基因，分析并比較紅曲霉重組丙酮酸脫羧酶與野生型丙酮酸脫羧酶的活性與動力學性質的差別。
　　 方法：使用Trizol提取紅曲霉的總RNA，利用Creator SMART cDNA文

2、庫構建試劑盒構建紅曲霉cDNA文庫，篩選丙酮酸脫羧酶基因，利用聚合酶鏈反應(PCR)技術從克隆載體DNA中擴增出pdc基因。對擴增片段和表達質粒進行酶切后連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5α，涂布于氨芐青霉素抗性平板，37℃培養(yǎng)過夜，挑取若干單克隆菌落進行PCR鑒定，陽性克隆產物送去測序。將重組質粒pET-PDC轉化大腸桿菌BL21(DE3)，涂布于氨芐青霉素抗性平板，37℃培養(yǎng)過夜，挑取若干單克隆菌落進行PCR鑒定。IPTG誘導表達陽性

3、轉化菌，SDS-PAGE檢測目的蛋白，通過Ni2+-NTA agarose親和層析純化后進行稀釋復性。
　　 將紅曲霉在馬鈴薯培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)7天，收集菌體，超聲波破碎細胞，離心，取上清。硫酸銨（NH4）2SO4鹽析獲得粗酶液，分別經凝膠層析柱SephadexG-25與DEAE陰離子交換柱純化蛋白。SDS-PAGE檢測純度。
　　 分別測重組PDC和野生型PDC的活性，并分別分析二者的動力學性質，比較兩者的異同點。

4、r>　　 結果：成功構建紅曲酶cDNA文庫，篩選得到了紅曲霉丙酮酸脫羧酶pdc基因，pdc基因的開放閱讀框長1713 bp，編碼一個570個氨基酸殘基的蛋白質，其序列已向GenBank提交并被收錄，序列號為HM 191265。重組PDC在原核細胞E.coli BL21(DE3)中高效表達，約占菌體總蛋白的32.7％，經親和層析純化，重組蛋白的純度達95％左右。偶聯酶法測定該酶的活性，二者的最適反應條件均為pH 6.0，30℃，在最適條