苦豆子賴氨酸脫羧酶基因克隆及表達(dá)分析.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、賴氨酸脫羧酶(Lysine Decarboxylase,LDC)基因是苦豆子(Sophora alopecuroidesL.)苦參堿(Matrine,MA)和氧化苦參堿(Oxymatrine,OMA)生物合成途徑的第一個關(guān)鍵酶基因,在其生化代謝過程中起著重要的作用。本研究以西北特有中藥材苦豆子為材料,克隆其賴氨酸脫羧酶基因編碼區(qū)和啟動子序列,分析不同苦豆子居群賴氨酸脫羧酶基因編碼區(qū)序列多樣性,挖掘與OMA含量相關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn),探討該基

2、因表達(dá)與MA和OMA含量的關(guān)系,驗證其啟動子的功能,旨在揭示賴氨酸脫羧酶基因的功能,為通過遺傳工程等手段培育高M(jìn)A和OMA含量的苦豆子奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下:
  (1)采用同源克隆技術(shù)從苦豆子中分離得到長度為1368bp的DNA片段,經(jīng)測序、BLAST驗證為賴氨酸脫羧酶基因編碼區(qū)序列,命名為SaLDC(登錄號:KM249871)。生物信息學(xué)分析表明,苦豆子賴氨酸脫羧酶基因編碼區(qū)與苦參(Sophora flavescens)和狗苦

3、參(Echinosophorakoreensis)賴氨酸脫羧酶基因序列一致性高達(dá)97%,該基因共編碼455個氨基酸殘基,蛋白質(zhì)分子量49.14KD,屬于PLPDEⅢ超基因家族。在氨基酸序列中找到了產(chǎn)喹諾里西啶類生物堿(Quinolizidine Alkaloids,QAs)植物的賴氨酸脫羧酶蛋白的特征性保守位點(diǎn)Phe340。聚類結(jié)果顯示,苦豆子與產(chǎn)QAs的植物聚為一個大類。
  (2)采用染色體步移技術(shù),先后分別獲得約800bp和

4、1500bp的DNA片段,經(jīng)測序、拼接后獲得長度為1948bp的苦豆子賴氨酸脫羧酶基因啟動子片段。生物信息學(xué)分析該基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)可能位于起始密碼子上游45bp處,其核心啟動子元件TATA box和CAAT box分別位于-27bp和-81bp處。在啟動子區(qū)域存在有大量的與光響應(yīng)、逆境防御應(yīng)答、激素響應(yīng)、組織特異性表達(dá)相關(guān)的順式作用元件,推測苦豆子賴氨酸脫羧酶在生命活動過程中較為活躍,能夠行使復(fù)雜的生物學(xué)功能。
  (3)對16個

5、苦豆子居群賴氨酸脫羧酶基因編碼區(qū)序列多樣性研究表明,該基因中間部分較為保守,變異主要存在與5'端和3'端。在16個苦豆子居群賴氨酸脫羧酶基因編碼區(qū)中共找到35個SNP,其中同義突變13個,錯義突變22個,SNP發(fā)生頻率為1SNP/39.08bp。Tajima'D值檢測和Ka/Ks結(jié)果顯示,16個居群苦豆子賴氨酸脫羧酶基因編碼區(qū)進(jìn)化不符合中性模型,受負(fù)向選擇作用。將SNP位點(diǎn)與氧化苦參堿含量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,共找到6個有價值的突變位點(diǎn),可用于

6、篩選高含量氧化苦參堿苦豆子的Caps引物開發(fā)。
  (4)用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG模擬干旱脅迫萌動苦豆子種子和幼苗,結(jié)果顯示:干旱脅迫下,子葉中MA和OMA的含量和賴氨酸脫羧酶基因表達(dá)量下降,但重度脅迫(PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)>20%)卻使子葉中賴氨酸脫羧酶基因表達(dá)量上升,且超過對照。葉片中賴氨酸脫羧酶基因表達(dá)量和OMA含量隨PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)和脅迫時間的變化呈動態(tài)變化趨勢,重度脅迫下,賴氨酸脫羧酶基因的表達(dá)和OMA的積累均被抑制;輕度和中度干旱

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