大腸桿菌L-谷氨酸脫羧酶定點(diǎn)突變及其酶學(xué)性質(zhì)初步研究.pdf

1、L-谷氨酸脫羧酶( L-glutamate decarboxylase, GAD)是生物法生產(chǎn)γ-氨基丁酸(gama-aminobutyric,簡(jiǎn)稱GABA)的關(guān)鍵酶。大腸桿菌谷氨酸脫羧酶對(duì)L-谷氨酸具有嚴(yán)格的底物專一性,但是野生型L-谷氨酸脫羧酶的最適pH過(guò)低,酶活的最適pH為3.8-4.5,酶分子在pH高于6.0時(shí)易發(fā)生解聚而失活,這限制了它的工業(yè)應(yīng)用。由于工業(yè)生產(chǎn)GABA所用底物為L(zhǎng)-谷氨酸鈉,該物質(zhì)呈中性偏堿,為了達(dá)到L-谷氨酸

2、脫羧酶最適pH條件,生產(chǎn)時(shí)必須向反應(yīng)體系中加入大量的鹽酸或硫酸,這一方面造成了額外的原料成本和后續(xù)的廢水處理成本,另一方面,酸性反應(yīng)條件對(duì)于生產(chǎn)設(shè)備的腐蝕性大大增加,加速設(shè)備老化,降低了生產(chǎn)設(shè)備的使用壽命,也增加了額外的成本。因此,在保持谷氨酸脫羧酶活性的基礎(chǔ)上,提高其pH適應(yīng)性成為工業(yè)生產(chǎn)的迫切需要。
　　為達(dá)到上述目的,Eugenia Pennacchietti等對(duì)大腸桿菌谷氨酸脫羧酶末端兩個(gè)氨基酸進(jìn)行了置換和缺失突變,發(fā)現(xiàn)對(duì)

3、465位組氨酸的突變能顯著拓寬其pH適應(yīng)范圍,當(dāng)pH在5.9時(shí),突變體的酶活是野生型酶活的4倍多,但更具體的酶學(xué)性質(zhì)未做詳細(xì)的研究。
　　本研究克隆了來(lái)源于大腸桿菌的GAD編碼基因gadB,按照文獻(xiàn)對(duì)其進(jìn)行了定點(diǎn)突變,使C末端缺失兩個(gè)氨基酸,并對(duì)這兩個(gè)酶的pH適應(yīng)性、pH穩(wěn)定性及最適溫度和溫度穩(wěn)定性等酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)的對(duì)比研究,從而為突變的谷氨酸脫羧酶在工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用提供理論依據(jù)和借鑒。
　　得出以下結(jié)論:
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4、本文對(duì)編碼來(lái)源于大腸桿菌谷氨酸脫羧酶的gadB基因進(jìn)行了定點(diǎn)突變,分別構(gòu)建了表達(dá)野生型GadB和突變型GadB△HT的基因工程菌。
　　2在獲得高表達(dá)的基礎(chǔ)上,對(duì)兩個(gè)酶的最適溫度、最適pH、溫度穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性進(jìn)行了系統(tǒng)研究,證實(shí)了突變酶GadB△HT在保持了與野生型相當(dāng)?shù)拇呋钚缘那疤嵯?表現(xiàn)出更廣泛的pH適應(yīng)能力,在pH3.4-6.2的范圍內(nèi),仍能保持50％以上的催化活性。
　　3對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物利用HPLC進(jìn)行了檢測(cè),其中

5、經(jīng)30min反應(yīng)后,0.1g濕菌體的野生型GAD轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中GABA濃度為10.34g/L,計(jì)算可知基因工程菌表達(dá)了33460U/g濕菌體的酶活;0.1g濕菌體的突變型GAD轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中GABA濃度為11.28g/L,計(jì)算可知基因工程菌表達(dá)了36500U/g濕菌體的酶活。在pH4.2和30℃條件下,突變后的GAD酶與野生型酶的活性差別不大。
　　4發(fā)酵菌體轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),10g菌體,加入182.5g/L谷氨酸鈉后轉(zhuǎn)化22h,高表達(dá)野生型GA