內(nèi)皮祖細(xì)胞在股骨頭壞死發(fā)病機(jī)制及治療中的作用研究.pdf

1、第一部分
　　 目的：一旦發(fā)生股骨頭缺血性壞死，股骨頭局部血管的損傷和極弱的側(cè)枝循環(huán)必然導(dǎo)致預(yù)后較差。而循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞主要維持血管的穩(wěn)定如血管修復(fù)和新生血管形成。本研究調(diào)查缺血性股骨頭壞死患者循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)目和功能是否異常，并探討與股骨頭發(fā)生機(jī)制的關(guān)系。
　　 方法： 選擇2007－2008年就診54例非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者，其中激素誘發(fā)組21例，酒精誘發(fā)組15例，自發(fā)組18例；以及30例健康體檢者（對(duì)照組）。流式細(xì)

2、胞儀對(duì)循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞計(jì)數(shù)，從外周血單個(gè)核細(xì)胞提取內(nèi)皮祖細(xì)胞,在預(yù)鋪有人纖維連接蛋白培養(yǎng)板上培養(yǎng)，通過(guò)攝取Dil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍祝―il-ac-LDL）和 FITC標(biāo)記的荊豆凝集素（FITC-UEA-1）對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行雙標(biāo)記鑒定。54例患者及30例對(duì)照組均觀測(cè)內(nèi)皮祖細(xì)胞集落形成能力。選每組年齡相匹配的10例檢測(cè)內(nèi)皮祖細(xì)胞向趨化因子（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子）的遷移能力，β-半乳糖苷酶檢測(cè)細(xì)胞衰老狀態(tài)，以及在Matrigel上形成連接小管

3、的數(shù)目檢測(cè)體外成血管能力。
　　 結(jié)果：股骨頭缺血性壞死患者循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)目（1460±265個(gè)/毫升全血）較健康對(duì)照者（545±177個(gè)/毫升全血）顯著降低（(P<0.001）。其集落形成能力較健康對(duì)照組顯著下降（19.6±7.7vs26.2±6.2，P<0.001）。盡管激素組、酒精組、自發(fā)組之間循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)目和集落形成能力無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，激素組和酒精等危險(xiǎn)因素均引起循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)目和集落形成能力的下降。此外與正常相

4、比，股骨頭缺血性壞死患者循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移能力下降，衰老增多，成血管能力也受損。
　　 結(jié)論：股骨頭缺血性壞死患者循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)目和功能均下降，表明股骨頭缺血性壞死的危險(xiǎn)因素能改變內(nèi)皮祖細(xì)胞的生物學(xué)性能并最終引起成血管及血管修復(fù)能力下降。
　　 第二部分
　　 目的：在血管新生及血管修復(fù)過(guò)程中，低氧誘導(dǎo)因子-1α是氧依賴型基因調(diào)節(jié)關(guān)鍵因子。激活低氧誘導(dǎo)因子-1α的表達(dá)，能促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)低氧誘導(dǎo)的病理生理過(guò)程(

5、如缺血性疾病)的血管修復(fù)。本研究觀察激活低氧誘導(dǎo)因子-1α的激活劑，二甲基乙二酰基甘氨酸對(duì)兔骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖和功能的生物學(xué)影響，并探討其可能的生物學(xué)機(jī)制。
　　 方法：從兔骨髓單個(gè)核細(xì)胞分離、培養(yǎng)提取EPCs。以不同濃度(0μM、50μM、100μM、200μM、500μM、1000μM)的二甲基乙二?；拾彼?DMOG)干預(yù)EPCs，激活激活低氧誘導(dǎo)因子-1α，MTT檢測(cè)其增殖活性，觀察細(xì)胞形成集落能力并計(jì)數(shù)。采用免疫印跡

6、方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)低氧誘導(dǎo)因子-1α的蛋白表達(dá)。EPCs 生成一氧化氮(NO)的產(chǎn)量由Griess法測(cè)定。EPCs分泌的VEGF和 SDF-1由Elisa試劑盒檢測(cè)。同時(shí)檢測(cè)內(nèi)皮祖細(xì)胞向趨化因子(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)的遷移能力，β-半乳糖苷酶檢測(cè)細(xì)胞衰老狀態(tài)，以及在Matrigel上形成連接小管的數(shù)目檢測(cè)體外成血管能力。
　　 結(jié)果：低氧誘導(dǎo)因子-1α的激活劑，二甲基乙二酰基甘氨酸能顯著激活EPCs中HIF-1α蛋白表達(dá)，6h表達(dá)達(dá)到

7、高峰。DMOG能顯著增加細(xì)胞的增長(zhǎng)率及活性，且成劑量依賴關(guān)系，其中500μM濃度的DMOG對(duì)EPCs增殖作用達(dá)到峰值。DMOG能明顯促進(jìn)EPCs 生成一氧化氮及分泌VEGF和 SDF-1，但均可被HIF-1α抗體中和。同時(shí)DMOG增加EPCs集落形成能力(P<0.001)，抑制細(xì)胞的衰老(P<0.05)，并顯著提高EPCs的的遷移能力和體外成血管功能。
　　 結(jié)論：低氧誘導(dǎo)因子-1α的激活劑能顯著提高內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖能力，以及細(xì)胞

8、集落形成能力、遷移能力和成血管功能，該激活劑刺激低氧誘導(dǎo)因子-1α，介導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞生成一氧化氮，并分泌VEGF和 SDF-1。因此低氧誘導(dǎo)因子-1α的激活劑介導(dǎo)的EPCs細(xì)胞治療具有廣泛的應(yīng)用前景。
　　 第三部分
　　 目的在血管新生及血管修復(fù)過(guò)程中，低氧誘導(dǎo)因子-1α是氧依賴型基因調(diào)節(jié)關(guān)鍵因子。激活低氧誘導(dǎo)因子-1α的表達(dá)，能在體內(nèi)外改善內(nèi)皮祖細(xì)胞功能，并發(fā)揮對(duì)低氧誘導(dǎo)的病理生理過(guò)程（如缺血性疾?。┑募?xì)胞治療。本研究

9、觀察激活低氧誘導(dǎo)因子-1α的激動(dòng)劑，二甲基乙二?；拾彼幔―MOG）對(duì)激素性兔壞死的療效觀察，探討內(nèi)皮祖細(xì)胞在此過(guò)程過(guò)程中發(fā)揮的生物學(xué)作用。
　　 方法： 采用低劑量的脂多糖聯(lián)合高劑量的甲強(qiáng)龍（L-LPS×2+H-MPS×3）建立兔骨壞死模型，分為治療組和對(duì)照組。治療組兔肌肉注射DMOG 20mg/kg，1，3，5，7 間斷干預(yù)1周；對(duì)照組給予等量的生理鹽水。采集實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)本前抽取外周血液，流式檢測(cè)循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)目。干預(yù)后4周

10、提取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雙側(cè)股骨，制成石蠟切片和硬組織切片，以進(jìn)行免疫組織化學(xué)、組織學(xué)和組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)，分析DMOG治療骨壞死的療效，評(píng)估組織形成新生血管及成骨能力。
　　 結(jié)果：低氧誘導(dǎo)因子-1α的激活劑，二甲基乙二?；拾彼崮苊黠@改善骨壞死，促進(jìn)壞死區(qū)新骨形成，提高血管密度，激活壞死骨組織中的HIF-1α蛋白表達(dá)。DMOG能顯著增加血管的新生，其血管密度明顯較對(duì)照組提高（14.7±4.1vs5.8±2.3，P<0.001）。組織學(xué)分析顯

11、示還說(shuō)明DMOG能明顯促進(jìn)壞死組織的新生骨形成(5.86±1.24vs2.71±0.93，P<0.05)。同時(shí)DMOG增加外周內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)目，提高壞死區(qū)域中歸巢內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)目。
　　 結(jié)論：DMOG能激活壞死組織低氧誘導(dǎo)因子-1α蛋白的表達(dá)，顯著改善骨壞死，提高骨新生能力及血管新生能力。DMOG通過(guò)動(dòng)員釋放并遷移內(nèi)皮祖細(xì)胞到缺血的壞死組織，從而提高壞死組織血管新生以達(dá)到治療的效果。因此低氧誘導(dǎo)因子-1α的激活劑介導(dǎo)的EPCs