Progranulin在股骨頭壞死軟骨退變及骨肉瘤中的作用及機制研究.pdf

1、股骨頭壞死(Osteonecrosis of femoral head，ONFH)是骨關節(jié)系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病，病變早期患者以髖關節(jié)疼痛及活動障礙為主要臨床表現(xiàn)，隨著病情逐漸加重，逐漸累及關節(jié)間隙使間隙變窄、致髖關節(jié)關節(jié)炎、甚至股骨頭變形塌陷、關節(jié)融合，給患者生活帶來巨大影響，后期往往需要行髓心減壓、關節(jié)融合、關節(jié)置換等手術治療。髖關節(jié)外傷股骨頸骨折、大量攝入酒精、長期大量應用糖皮質(zhì)激素、減壓病等是股骨頭壞死的常見病因，但其確切的病理發(fā)

2、病機制尚不完全清楚，血管損傷血運障礙學說、脂質(zhì)代謝紊亂學說等是研究較多的關于發(fā)病機制學說，隨著基因分子生物學的發(fā)展，對疾病的認識逐漸向微觀方向發(fā)展、逐漸深入到分子基因水平。前期研究發(fā)現(xiàn)在壞死的股骨頭骨質(zhì)及關節(jié)液中多種炎癥因子高表達，同時發(fā)現(xiàn)在股骨頭壞死患者關節(jié)液及關節(jié)軟骨中發(fā)現(xiàn)軟骨降解產(chǎn)物，軟骨退變被證實在股骨頭壞死病變早期已經(jīng)開始發(fā)生，說明股骨頭壞死病變是一個整體，涉及到股骨頭骨質(zhì)、關節(jié)軟骨、關節(jié)液以及相關的炎癥因子，炎癥反應和軟骨退

3、變參與了疾病的發(fā)生發(fā)展，但關于軟骨退變?nèi)绾伟l(fā)生、炎癥反應如何起作用尚不明確。為了進一步加深對股骨頭壞死病理機制的認識，應重視軟骨退變在疾病進展中的作用，并研究軟骨退變及炎癥反應在病變過程中作用機制。
　　骨肉瘤(Osteosarcoma)是骨關節(jié)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，青少年患者多發(fā)，每年每百萬人中約有6-8個新發(fā)病患者。由于腫瘤惡性程度高、易復發(fā)、易耐藥、易早期發(fā)生遠處轉移等特點，使治療效果不理想很難令人滿意。1970年以前

4、對骨肉瘤的治療以截肢作為最常用的治療方案，但僅有不到10％的5年生存率。目前國際上通用的標準的骨肉瘤治療方案是:術前新輔助化療盡量殺死骨肉瘤細胞并消滅微轉移灶、手術盡量完整徹底切除腫瘤、術后化療，治療效果有了明顯提高，但是自上世紀70年代以來五年生存率一直維持在60％-70％左右，未有明顯改善，因此為了改善骨肉瘤患者的預后、提高患者的生活質(zhì)量迫切需要研制新的藥物和方法。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉移中，生長因子及其激活的信號通路

5、發(fā)揮了較大的作用，因此生長因子及其激活的信號通路可以作為研究骨肉瘤治療的新思路。
　　Progranulin(PGRN)作為一種自分泌生長因子，具有多種生物功能，表達于多種組織內(nèi)如上皮組織、神經(jīng)組織、軟骨組織及多種腫瘤組織內(nèi)，研究證實:PGRN在軟骨細胞的發(fā)育、分化、增殖中起到重要作用;據(jù)報道，PGRN在多種腫瘤組織內(nèi)高表達，并對腫瘤的發(fā)生、進展、局部及遠處轉移起到重要作用。本研究目的是:檢測股骨頭壞死患者股骨頭軟骨及骨肉瘤中PG

6、RN的表達，并研究PGRN在股骨頭壞死軟骨退變及骨肉瘤中作用及機制，希望能夠發(fā)現(xiàn)新的診斷及治療靶點，以改進診斷治療方案，本研究首次對PGRN在股骨頭壞死軟骨及骨肉瘤中的表達及作用進行研究。
　　本研究分為兩部分:第一部分主要研究PGRN在股骨頭壞死軟骨退變中所起到的作用及機制;第二部分主要研究PGRN在骨肉瘤中的表達情況，以及PGRN對骨肉瘤細胞生長增殖、侵襲、遷移所起的作用及作用機制。
　　第—部分:股骨頭壞死軟骨退變中P

7、GRN表達及在病交中所起到的作用及機制研究目的:本研究的目的在于研究PGRN在股骨頭壞死軟骨及血清中的表達情況，探討其在股骨頭壞死軟骨退變中的作用及其作用機制。
　　研究方法:分別收集股骨頭和血清標本，股骨頭壞死患者作為實驗組、股骨頸骨折患者作為對照組，分別應用免疫組化、蛋白質(zhì)免疫印跡實驗(Western-blot技術)、聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測PGRN在軟骨中的表達、利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清中PGRN

8、的濃度;體外實驗:提取并培養(yǎng)股骨頭壞死軟骨細胞并加入PGRN刺激，檢測aggrecan和collagenⅡ等軟骨合成代謝產(chǎn)物的表達情況，及信號通路ERK1/2的激活情況。
　　研究結果:1.經(jīng)免疫組化實驗檢測、蛋白質(zhì)免疫印跡實驗(Western-blot)檢測及聚合酶鏈式反應(PCR)檢測示:股骨頭壞死組軟骨中PGRN的表達較股骨頸骨折組明顯增加，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)實驗示:實驗組血清中PGRN濃度高于對照組;2.經(jīng)免疫

9、組化和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測示:腫瘤壞死因子（TNF-α）在股骨肉壞死關節(jié)軟骨及關節(jié)液中表達高于對照組;3.重組PGRN能夠拮抗腫瘤壞死因子(TNF-α)刺激所導致的軟骨分解代謝4.重組PGRN能夠激活信號通路ERK1/2，促進軟骨細胞合成aggrecan和collagenⅡ，對軟骨細胞合成代謝起促進作用，在股骨頭壞死軟骨退變中起到一定的保護作用。
　　研究結論:PGRN能夠改善軟骨細胞的合成代謝、抑制分解代謝，在股骨

10、頭壞死軟骨退變病理進程中起到軟骨保護作用，此次研究加深了股骨頭壞死病變過程中對軟骨退變及PGRN對軟骨退變保護作用的認識。
　　第二部分:骨肉瘤中PGRN的表達，PGRN在骨肉瘤細胞生長、侵襲、遷移中的作用及作用機制。
　　研究目的:本研究的目的在于研究PGRN在骨肉瘤細胞、病人血清及骨肉瘤組織中的表達情況，并研究其對骨肉瘤細胞生長、侵襲及遷移的作用及相關機制。研究方法:收集骨肉瘤及瘤旁組織標本，經(jīng)免疫組化實驗、蛋白質(zhì)免疫印

11、跡實驗(Western-blot)、聚合酶鏈式反應(RT-PCR)實驗檢測組織中PGRN的表達;收集骨肉瘤患者及正常志愿者血清，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)對比兩組血清中PGRN濃度;經(jīng)細胞免疫熒光實驗檢測PGRN在骨肉瘤細胞中的是否表達，PGRN對骨肉瘤細胞活性、增殖的影響，是通過CCK-8實驗、流式細胞周期實驗檢測的;對骨肉瘤細胞運動、侵襲及遷移的影響是通過劃痕實驗及Transwell實驗來檢測的:利用重組PGRN刺激骨肉瘤細胞

12、并檢測MMP-2及相關信號通路Akt及mTOR的表達激活情況。
　　研究結果:1.對兩組組織進行免疫組化染色，提取兩組組織總蛋白進行蛋白質(zhì)免疫印跡實驗(Western Blot)，提取兩組RNA進行聚合酶鏈式反應(RT-PCR)結果表明:骨肉瘤組織中PGRN表達明顯高于瘤旁組織;收集兩組患者血清進行酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)結果表明:血清中PGRN的濃度實驗組高于健康對照組;對骨肉瘤HOS、Sao-2細胞系進行免疫熒光染色，染

13、色證明PGRN在以上兩種骨肉瘤細胞系表達;2.通過CCK-8實驗、劃痕實驗、流式細胞周期檢測試驗及Transwell實驗檢測發(fā)現(xiàn):PGRN在骨肉瘤細胞的生長增殖、侵襲及遷移過程中起重要的促進作用;3.隨著PGRN濃度的增高其促進骨肉瘤細胞中MMP-2的表達的作用逐漸增強，PGRN可以使Akt及mTOR信號通路快速磷酸化激活。
　　研究結論:研究中我們初次證實PGRN高表達于骨肉瘤織及患者血清，證實骨肉瘤細胞系中表達PGRN，發(fā)現(xiàn)P