發(fā)酵梅香魚微生物種群結構分析及發(fā)酵菌株篩選研究.pdf

1、傳統發(fā)酵梅香魚是依靠自然富集的微生物參與的發(fā)酵過程，由于受多種因素的影響，參與發(fā)酵的微生物不穩(wěn)定，導致產品質量極不穩(wěn)定。為了有效控制產品的質量與品質，本課題利用非可培養(yǎng)水平與可培養(yǎng)水平技術對廣東特色發(fā)酵梅香魚進行微生物多樣性分析，獲得種群結構，以此分離出參與自然發(fā)酵的優(yōu)勢菌株，并制備出不同發(fā)酵制劑，并人工模擬自然發(fā)酵工藝制備發(fā)酵魚，并對其進行品質質量鑒定。研究結果如下:
　　(1)未可培養(yǎng)水平下梅香魚微生物種群結構分析:本研究直接

2、從梅香魚中提取細菌的總DNA，對其進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，再利用細菌16S rDNA V4區(qū)的引物對符合要求的總DNA進行V4區(qū)的PCR擴增，繼而對PCR產物進行Illumina測序。通過對樣品16S rDNA V4可變區(qū)的PCR產物的測序結果進行分析，得到樣品在0.03距離下的OTU豐度，并繪制稀釋曲線圖，可以看出參與其發(fā)酵的微生物組成非常豐富，其中共有8個門被檢測到，分別是酸桿菌門(0.93％)、放線菌門(3.35％)、脫鐵桿菌門(

3、1.31％)、厚壁菌門(74.92％)、浮霉菌門(0.16％)、變形菌門(18.11％)、柔膜菌門(0.04％)及疣微菌門(0.09％)，其中優(yōu)勢菌門是厚壁菌門。在厚壁菌門中，豐度最高的菌屬分別是乳桿菌屬(25.36％)、葡萄球菌屬(19.27％)和四聯球菌屬(14.62％)，可被認為是參與發(fā)酵過程的優(yōu)勢菌屬。
　　(2)梅香魚發(fā)酵菌株的篩選:本實驗利用MRS(de Man, Rogosa and Sharp)、GAM（Gifu

4、anaerobic medium）和TSA(Trypticase Soy Agar)平板對梅香魚中微生物進行分離、純化，通過革蘭氏染色共篩選得到95株G+菌株，根據發(fā)酵菌株的要求，即過氧化氫酶陽性、發(fā)酵葡萄糖產酸不產氣、可耐受20％ NaCl、不產生組胺，且對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有明顯抑制作用，篩選到3株適合發(fā)酵的菌株。利用細菌通用引物1492 R和27 F作正反向引物進行16S rDNA擴增與測序，經Blast在線比對與系統發(fā)育

5、樹分析，確定3株菌分別為Tetragenococcus halophilus、Staphylococcusxylosus和 Staphylococcus saprophyticus。
　　(3)不同發(fā)酵劑對發(fā)酵魚品質的影響:通過繪制3株菌在10、20、30℃下的生長曲線，根據生長曲線選出最適發(fā)酵時間和溫度，分別為44 h和20℃。在該溫度下，設計Box-Behnken試驗，選取3株菌不同接種比例，即嗜鹽四聯球菌接種比例(0、1、2

6、)、木糖葡萄球菌接種比例(0、1、2)和腐生葡萄球菌接種比例(0、1、2)3個發(fā)酵影響顯著的因素水平，以感官評分為響應值，設計了三因素三水平共15個試驗點的響應面分析。利用Design Expert軟件對數據進行二次回歸分析，從而確定最佳菌株配比，即嗜鹽四聯球菌∶木糖葡萄球菌∶腐生葡萄球菌=1∶1∶1。通過測定各個發(fā)酵試驗組與空白對照組的感官指標、理化指標和微生物指標，得出接種發(fā)酵的魚制品明顯優(yōu)于空白對照組，而混合發(fā)酵魚制品又勝于單菌株

7、發(fā)酵，其中以最佳菌株配比發(fā)酵的魚制品最優(yōu)，其產品香氣濃郁，肉質鮮美，彈性足。
　　(4)發(fā)酵產品的安全性評價:通過7d灌胃試驗，觀察6組實驗組的小鼠，其形態(tài)表現上無明顯差異，且與陰性對照組（蒸餾水）小鼠相比也無明顯差異。在檢測發(fā)酵魚制品對生殖細胞的致突變性時，檢測到各個劑量試驗組小鼠的精子致畸率與陰性對照組（蒸餾水）相比無顯著性差異(p＞0.05)，而陽性對照組（環(huán)磷酰胺）與陰性對照組（蒸餾水）及各個劑量試驗組相比較差異極顯著(p