發(fā)酵梅香魚微生物種群結(jié)構(gòu)分析及發(fā)酵菌株篩選研究.pdf

1、傳統(tǒng)發(fā)酵梅香魚是依靠自然富集的微生物參與的發(fā)酵過(guò)程，由于受多種因素的影響，參與發(fā)酵的微生物不穩(wěn)定，導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量極不穩(wěn)定。為了有效控制產(chǎn)品的質(zhì)量與品質(zhì)，本課題利用非可培養(yǎng)水平與可培養(yǎng)水平技術(shù)對(duì)廣東特色發(fā)酵梅香魚進(jìn)行微生物多樣性分析，獲得種群結(jié)構(gòu)，以此分離出參與自然發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)菌株，并制備出不同發(fā)酵制劑，并人工模擬自然發(fā)酵工藝制備發(fā)酵魚，并對(duì)其進(jìn)行品質(zhì)質(zhì)量鑒定。研究結(jié)果如下:
　　(1)未可培養(yǎng)水平下梅香魚微生物種群結(jié)構(gòu)分析:本研究直接

2、從梅香魚中提取細(xì)菌的總DNA，對(duì)其進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，再利用細(xì)菌16S rDNA V4區(qū)的引物對(duì)符合要求的總DNA進(jìn)行V4區(qū)的PCR擴(kuò)增，繼而對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行Illumina測(cè)序。通過(guò)對(duì)樣品16S rDNA V4可變區(qū)的PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，得到樣品在0.03距離下的OTU豐度，并繪制稀釋曲線圖，可以看出參與其發(fā)酵的微生物組成非常豐富，其中共有8個(gè)門被檢測(cè)到，分別是酸桿菌門(0.93％)、放線菌門(3.35％)、脫鐵桿菌門(

3、1.31％)、厚壁菌門(74.92％)、浮霉菌門(0.16％)、變形菌門(18.11％)、柔膜菌門(0.04％)及疣微菌門(0.09％)，其中優(yōu)勢(shì)菌門是厚壁菌門。在厚壁菌門中，豐度最高的菌屬分別是乳桿菌屬(25.36％)、葡萄球菌屬(19.27％)和四聯(lián)球菌屬(14.62％)，可被認(rèn)為是參與發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)勢(shì)菌屬。
　　(2)梅香魚發(fā)酵菌株的篩選:本實(shí)驗(yàn)利用MRS(de Man, Rogosa and Sharp)、GAM（Gifu

4、anaerobic medium）和TSA(Trypticase Soy Agar)平板對(duì)梅香魚中微生物進(jìn)行分離、純化，通過(guò)革蘭氏染色共篩選得到95株G+菌株，根據(jù)發(fā)酵菌株的要求，即過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性、發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣、可耐受20％ NaCl、不產(chǎn)生組胺，且對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有明顯抑制作用，篩選到3株適合發(fā)酵的菌株。利用細(xì)菌通用引物1492 R和27 F作正反向引物進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增與測(cè)序，經(jīng)Blast在線比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育

5、樹分析，確定3株菌分別為Tetragenococcus halophilus、Staphylococcusxylosus和 Staphylococcus saprophyticus。
　　(3)不同發(fā)酵劑對(duì)發(fā)酵魚品質(zhì)的影響:通過(guò)繪制3株菌在10、20、30℃下的生長(zhǎng)曲線，根據(jù)生長(zhǎng)曲線選出最適發(fā)酵時(shí)間和溫度，分別為44 h和20℃。在該溫度下，設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)，選取3株菌不同接種比例，即嗜鹽四聯(lián)球菌接種比例(0、1、2

6、)、木糖葡萄球菌接種比例(0、1、2)和腐生葡萄球菌接種比例(0、1、2)3個(gè)發(fā)酵影響顯著的因素水平，以感官評(píng)分為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)了三因素三水平共15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析。利用Design Expert軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸分析，從而確定最佳菌株配比，即嗜鹽四聯(lián)球菌∶木糖葡萄球菌∶腐生葡萄球菌=1∶1∶1。通過(guò)測(cè)定各個(gè)發(fā)酵試驗(yàn)組與空白對(duì)照組的感官指標(biāo)、理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)，得出接種發(fā)酵的魚制品明顯優(yōu)于空白對(duì)照組，而混合發(fā)酵魚制品又勝于單菌株

7、發(fā)酵，其中以最佳菌株配比發(fā)酵的魚制品最優(yōu)，其產(chǎn)品香氣濃郁，肉質(zhì)鮮美，彈性足。
　　(4)發(fā)酵產(chǎn)品的安全性評(píng)價(jià):通過(guò)7d灌胃試驗(yàn)，觀察6組實(shí)驗(yàn)組的小鼠，其形態(tài)表現(xiàn)上無(wú)明顯差異，且與陰性對(duì)照組（蒸餾水）小鼠相比也無(wú)明顯差異。在檢測(cè)發(fā)酵魚制品對(duì)生殖細(xì)胞的致突變性時(shí)，檢測(cè)到各個(gè)劑量試驗(yàn)組小鼠的精子致畸率與陰性對(duì)照組（蒸餾水）相比無(wú)顯著性差異(p＞0.05)，而陽(yáng)性對(duì)照組（環(huán)磷酰胺）與陰性對(duì)照組（蒸餾水）及各個(gè)劑量試驗(yàn)組相比較差異極顯著(p