陜西稠酒發(fā)酵優(yōu)勢微生物分離篩選及鑒定.pdf

1、稠酒，是霉菌、酵母、和細(xì)菌等幾種主要微生物經(jīng)過糖化、酸化和酯化形成的多風(fēng)味物質(zhì)。傳統(tǒng)稠酒是混合菌發(fā)酵，因此，稠酒優(yōu)勢微生物的組成直接影響稠酒的質(zhì)量和風(fēng)味。本文以陜西當(dāng)?shù)爻砭菩∏鸀樵?，利用傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)并結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)對稠酒發(fā)酵過程中微生物的動(dòng)態(tài)變化做了分析，并對曲中的優(yōu)勢微生物進(jìn)行了分離篩選和鑒定，同時(shí)以篩選得到的優(yōu)勢菌株為出發(fā)菌株，初步進(jìn)行純種制曲。主要研究結(jié)果為：
　　 1．采用菌落計(jì)數(shù)法，分析了稠酒發(fā)酵過程中霉菌、酵母

2、及細(xì)菌的數(shù)量變化情況。在整個(gè)發(fā)酵階段，霉菌數(shù)量呈現(xiàn)下降的趨勢，而在發(fā)酵前期，酵母利用霉菌糖化產(chǎn)生的葡萄糖進(jìn)行繁殖代謝，后期則利用葡萄糖進(jìn)行厭氧發(fā)酵，因而呈現(xiàn)先增后減的趨勢；而細(xì)菌在發(fā)酵階段的數(shù)目均高于霉菌和酵母，達(dá)到109cfu/g，但細(xì)菌數(shù)量隨發(fā)酵的進(jìn)行數(shù)量變化不大。
　　 2．運(yùn)用傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)并結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)對稠酒發(fā)酵中的優(yōu)勢微生物進(jìn)行了分離、篩選和鑒定。
　　 (1)采用糖化透明圈法對霉菌進(jìn)行初篩，獲得7株較優(yōu)

3、霉菌。對7株霉菌的糖化發(fā)酵試驗(yàn)，測定其糖化能力。其中霉菌R2在72h內(nèi)糖化產(chǎn)生的葡萄糖含量明顯高于其他菌株，達(dá)到5.4％。對R2進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果表明：R2具有有假根、孢囊孢子、匍匐菌絲、菌絲無隔膜等根霉的典型形態(tài)特征，初步鑒定為根霉屬。對R2進(jìn)行ITS序列學(xué)分析，結(jié)果表明：霉菌R2與Rhizopus oryzae序列很相似，同源性達(dá)到100％，確定R2在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)中的分類地位為：真菌界(Kingdom Fungi)，接合菌門(Phy

4、lum Zygomycota)，接合菌綱（ClassZygomycetes），毛霉目（OrderMucorales），毛霉科(FamilyMucoraceae)，根霉屬（Genus Rhizopus），米根霉種(Rhizopusoryzae)。
　　 (2)從小曲中共篩選出11株具有典型性特征的酵母菌，對這11株酵母進(jìn)行產(chǎn)酒能力試驗(yàn)，結(jié)果表明：酵母Y7TTC顯色呈深紅色，杜氏管試驗(yàn)中，Y7在發(fā)酵4h即開始產(chǎn)氣，且在產(chǎn)酒精能力試驗(yàn)

5、中，Y7在60h內(nèi)還原糖含量降低的最快，為0.66％，終產(chǎn)酒精最高，達(dá)到10.7％。酵母Y3TTC顯色呈粉紅紅色，杜氏管試驗(yàn)中，Y3在發(fā)酵8h即開始產(chǎn)氣，起酵速度略慢。在糯米試飯?jiān)囼?yàn)中，酵母Y7產(chǎn)酒精度最高為10.5％，而酵母Y3產(chǎn)揮發(fā)酯含量最高，為1.21g/100ml。確定了酵母Y3與Y7的最佳生長溫度為28℃，最佳生長pH值為5～5.5，酵母Y3與Y7在麥芽汁中培養(yǎng)2h后進(jìn)入對數(shù)生長期，12h后生長達(dá)到最旺盛時(shí)期，且穩(wěn)定期持續(xù)達(dá)2

6、0h。對兩株酵母進(jìn)行ITS序列分析并結(jié)合生理生化鑒定，結(jié)果表明：酵母Y3與Candida utilis序列很相似，同源性達(dá)到99.52％，鑒定為真菌界(Kingdom Fungi)，半知菌類(Fungiimperfectii)，叢梗孢目（Moniliales），隱球酵母科（Cryptococcaceae），假絲酵母屬(Candida Berkhout)，產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）。酵母Y7與Saccharomyces

7、cerevisiae序列很相似，同源性達(dá)到97.62％，鑒定為真菌界(Kingdom Fungi)，子囊菌門(Ascomycota)，半子囊菌綱（Hemiascomycetes），酵母目（Saccharomycetaceae），酵母科（Saccharomyces）酵母屬（Saccharomyces），釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
　　 (3)從小曲中篩選出1株革蘭氏陽性，過氧化氫陰性的細(xì)菌，通過乳

8、酸的定性分析，確定了該菌為乳酸菌，對乳酸菌進(jìn)行16srDNA序列學(xué)分析，結(jié)果表明：該乳酸菌B與Pediococcus pentosaceus序列很相似，同源性達(dá)到100％，結(jié)合生理生化鑒定結(jié)果，確定該乳酸菌為細(xì)菌界(Bacteria)，厚壁菌門(Firmicutes)，芽孢桿菌綱(Bacilli)，鏈球菌科(Streptococcaceae)，片球菌屬(Pediococcus)，戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus