四種農(nóng)業(yè)生境昆蟲內(nèi)生放線菌的篩選、鑒定及抗菌活性研究.pdf

1、天然產(chǎn)物(Natual Products)是普遍地存在于整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的特殊物質(zhì)，是生物活性物質(zhì)和實(shí)用藥物發(fā)現(xiàn)的重要源泉，在人類的社會(huì)生活中扮演了重要角色。隨著抗生素耐藥性問題的日益嚴(yán)峻，迫使新藥的研發(fā)效率急需不斷提高。目前，從傳統(tǒng)分離源中分離新活性天然產(chǎn)物的幾率不斷地降低，進(jìn)而新分離源的探索不斷引起研究者的關(guān)注。昆蟲種類豐富，其分布也極為廣泛，幾乎遍布地球上的各種生境。昆蟲共生微生物的獨(dú)特活性代謝產(chǎn)物，也引起了研究者們的極大興趣。其中，

2、昆蟲共生放線菌的活性代謝產(chǎn)物研究不斷受到研究者的關(guān)注。因此，本研究以昆蟲綱中第一大目鞘翅目甲蟲為分離研究對(duì)象，進(jìn)行內(nèi)生放線菌多樣性研究。將篩選獲得的內(nèi)生放線菌進(jìn)行新種鑒定和抗病原微生物活性評(píng)價(jià)，并對(duì)活性菌株的活性代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果如下:
　　(1)從多種昆蟲樣本中共分離得到內(nèi)生放線菌41株，通過形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及部分16S rRNA分析，將這41株菌歸類為放線菌的4個(gè)屬，包括鏈霉菌屬（Streptomyces）27株，小

3、單孢菌屬（Micromonospora）11株，鏈孢囊菌屬（Streptosporangium）2株及野野村菌屬（Nonom uraea）1株。
　　(2)綜合運(yùn)用多相性分類鑒定方法對(duì)菌株NEAU-CX1進(jìn)行分類學(xué)鑒定。通過16S rRNA基因序列分析判斷該菌屬于小單孢菌屬。菌株NEAU-CX1與Micromonospora coxensis JCM13248T(99.3％),Micromonospora purpureochro

4、mogenes DSM43821T(99.1％)和Micromonospora siamensis TT2-4 JCM12769T(99.1％)的16S rRNA基因序列相似性最高，與小單孢菌屬的其它菌株的相似性均低于99％。利用鄰位連接法和最大似然法將菌株NEAU-CX1與該屬的相關(guān)菌株的16S rRNA和gryB基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，分析結(jié)果表明，兩種方法得到的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相同，菌株NEAU-CX1與M.purpureochromog

5、enes DSM43821T形成獨(dú)立分支。通過形態(tài)特征、生理生化特性、系統(tǒng)分類學(xué)及DNA雜交分析確定NEAU-CX1屬于小單孢菌屬的一個(gè)新種，命名為Micromonospora palomenae，保藏在中國科學(xué)院微生物研究所和日本理化學(xué)研究所微生物菌種保藏中心(=CGMCC4.7175T=JCM30056T)。
　　(3)綜合運(yùn)用多相性分類鑒定方法對(duì)菌株NEAU-JC6進(jìn)行分類學(xué)鑒定。通過16S rRNA基因序列分析判斷該菌屬于

6、小單孢菌屬。菌株NEAU-JC6與M.haikouensis DSM45626T(99.3％),M.carbonacea JCM3139T(99.1％)和M.krabiensis JCM12869T(99.1％)的16SrRNA基因序列相似性最高，與小單孢菌屬其它菌株的相似性均低于98％。利用鄰位連接法和最大似然法將菌株NEAU-JC6與該屬的相關(guān)菌株的16S rRNA和gryB基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，分析結(jié)果表明，兩種方法得到的拓?fù)浣Y(jié)

7、構(gòu)相同，菌株NEAU-JC6與M.haikouensis DSM45626T形成獨(dú)立分支。通過形態(tài)特征、生理生化特性、系統(tǒng)分類學(xué)及DNA雜交分析確定NEAU-JC6屬于小單孢菌屬的一個(gè)新種，命名為Micromonospora harpali，保藏在中國科學(xué)院微生物研究所和日本理化學(xué)研究所微生物菌種保藏中心(=CGMCC4.7173T=JCM30055T)。
　　(4)綜合運(yùn)用多相性分類鑒定方法對(duì)菌株NEAU-FHSN1進(jìn)行分類學(xué)鑒

8、定。通過16SrRNA基因序列分析判斷該菌屬于鏈孢囊菌屬。菌株NEAU-FHSN1與Streptosporangtumshengliensis NEAU-GH7T(98.7％)的16S rRNA基岡序列相似性最高。利用鄰位連接法和最大似然法將菌株NEAU-FHSN與該屬的相關(guān)菌株的16S rRNA基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，分析結(jié)果表明，兩種方法得到的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相同，菌株NEAU-FHSN1與Streptosporangtum roseumJ

9、CM3005T(98.6％),Streptosporangtum vulgare DSM43802T(98.6％),Streptosporangtumcanum HBUM170018T(98.5％)和Streptosporangtum album DSM43023T(98.4％)形成一個(gè)獨(dú)立的分枝，與最高相似度菌株S.shengliensis NEAU-GH7T(98.7％)分枝距離較遠(yuǎn)。通過形態(tài)特征、生理生化特性、系統(tǒng)分類學(xué)及DNA雜

10、交分析確定NEAU-FHSN1屬于鏈孢囊菌屬的一個(gè)新種，命名為Streptosporangium lutulentum，保藏在中國科學(xué)院微生物研究所和德國不倫瑞克市德國菌種保藏中心(=CGMCC4.7141T=DSM46740T)。
　　(5)通過對(duì)41株共生放線菌進(jìn)行生物活性體外測試，得到2株生物活性較好的菌株，分別為C7(NEAU-TLV1)和C24(NEAU-T4)，其中C7發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)受試細(xì)菌活性較好，C24發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)受試植