熒光探針的制備及生物成像應(yīng)用.pdf

1、熒光探針是指熒光性質(zhì)(如熒光強(qiáng)度、熒光壽命、激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng))受到周圍環(huán)境影響、特定刺激、結(jié)合被分析物而發(fā)生特異性改變(熒光探針顏色變化、熒光強(qiáng)度變化、紫外吸收光譜變化)的一類熒光物質(zhì)。熒光探針包括有機(jī)染料、發(fā)光納米顆粒、熒光蛋白等,已經(jīng)被廣泛研究并被應(yīng)用于環(huán)境檢測(cè)、有毒有害物質(zhì)分析檢測(cè)、生物化學(xué)檢測(cè)、腫瘤成像與細(xì)胞成像等領(lǐng)域。硫化氫化學(xué)性質(zhì)活潑,具有還原性、親核性、絡(luò)合金屬離子等性質(zhì)。硫離子S2-作為重要的信號(hào)分子參與了許多疾病過(guò)程,是

2、衡量中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要指標(biāo)。實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)H2S含量的變化具有重要意義。
　　同時(shí)納米載體已經(jīng)成為輸送基因藥物到細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)位置的重要工具。但傳統(tǒng)的基因載體基于陽(yáng)離子脂質(zhì)體或聚合物而設(shè)計(jì),其基因治療的效果與毒性由于進(jìn)入體內(nèi)之后難以觀察到而導(dǎo)致評(píng)價(jià)過(guò)程過(guò)于復(fù)雜。為實(shí)現(xiàn)示蹤基因釋放過(guò)程,熒光納米載體被證明是一種行之有效的工具。本論文主要利用新型有機(jī)熒光探針與納米熒光探針?lè)謩e實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)的熒光檢測(cè)與基因釋放的實(shí)時(shí)示蹤,基于其研究現(xiàn)狀(

3、第一章),取得成果如下:
　　1、第二章發(fā)展了一種具有高靈敏度、良好選擇性的識(shí)別硫化氫的方法,成功應(yīng)用于細(xì)胞成像,并對(duì)識(shí)別機(jī)理進(jìn)行探討,該機(jī)理與文獻(xiàn)報(bào)道的機(jī)理完全不同,為熒光探針設(shè)計(jì)提供了理論指導(dǎo)。硫化氫的檢測(cè)對(duì)于化工生產(chǎn)、生命分析有著重要意義,發(fā)展相應(yīng)的靈敏檢測(cè)方法至關(guān)重要。作為一種新型的有機(jī)熒光分子,1-氧-1H-非那烯-2,3-二腈(1-oxo-1H-phenalene-2,3-dicarbonitrile,OPD),具有優(yōu)

4、異的光譜與化學(xué)性質(zhì)。首先利用萘并乙二酮與丙二腈反應(yīng)合成OPD熒光探針,由于分子內(nèi)氰基的強(qiáng)吸電子作用, OPD熒光探針在576 nm處呈現(xiàn)弱熒光,但在硫化氫的還原作用下,OPD熒光探針發(fā)生加成、結(jié)構(gòu)重排、氧化、水解、消去反應(yīng),最終生成強(qiáng)熒光產(chǎn)物(Em=576 nm),并伴隨著溶液顏色由亮黃色變?yōu)樽霞t色,檢測(cè)限52nM,線性范圍1.0-30μM。利用核磁與質(zhì)譜,確定了OPD熒光探針與硫離子反應(yīng)后的熒光產(chǎn)物結(jié)構(gòu),并進(jìn)一步探究該反應(yīng)型熒光探針熒

5、光變化的機(jī)理,通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證水分子、空氣、OH-、S2-、有機(jī)溶劑等因素的作用,推測(cè)其反應(yīng)發(fā)生過(guò)程,提出一種新型反應(yīng)機(jī)理,并在Tris-HC1緩沖溶液中優(yōu)化pH等測(cè)試條件,成功實(shí)現(xiàn)OPD熒光探針在HeLa細(xì)胞內(nèi)硫離子的檢測(cè),為熒光探針設(shè)計(jì)提供了理論指導(dǎo)。
　　2、第三章成功發(fā)展了一種可以實(shí)時(shí)示蹤基因釋放的非病毒載體構(gòu)筑方法,并成功實(shí)現(xiàn)HeLa細(xì)胞內(nèi)熒光示蹤質(zhì)粒DNA釋放?；蛑委熢诎┌Y治療方面有著舉足輕重的作用,但是基因的負(fù)載

6、、運(yùn)輸、轉(zhuǎn)染效率、安全問(wèn)題、實(shí)時(shí)示蹤仍然是研究的難點(diǎn)。首先合成了熒光穩(wěn)定的LaF3:Ce3+-Tb3+熒光納米顆粒作為發(fā)光中心,采用自由基聚合的方法合成的正電性高分子聚合物聚-甲基丙烯酸甲酯-甲基咪唑(MMA-AMIM)作為載體,利用親水性功能高分子聚合物聚乙二醇-乳酸羥基乙酸(PEG-PLGA)為輔助分子,通過(guò)簡(jiǎn)單的超聲乳化方法,構(gòu)筑的LaF3: Ce3+-Tb3+@MMA-AMIM-PEG-PLGA納米復(fù)合球,形貌均一、生物相容性好

7、,實(shí)現(xiàn)了HeLa細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒DNA釋放的實(shí)時(shí)示蹤。 LaF3: Ce3+-Tb3+@MMA-AMIM-PEG-PLGA納米復(fù)合球載體既能負(fù)載負(fù)電基因又具有良好的水溶液分散性。并且質(zhì)粒DNA未進(jìn)入細(xì)胞核前無(wú)熒光,進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)出的紅色熒光蛋白由于發(fā)出紅光可以實(shí)時(shí)指示基因釋放的位置,而發(fā)綠色熒光的LaF3: Ce3+-Tb3+熒光納米顆粒則可以作為納米載體的內(nèi)標(biāo),一直指示納米載體從進(jìn)入細(xì)胞到細(xì)胞核的整個(gè)過(guò)程。該工作為實(shí)時(shí)示蹤基因釋放從而達(dá)到